摘 要:本發(fā)明公開了一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，該方法步驟流程包括對不同工業(yè)大麻產(chǎn)品進(jìn)行的前處理、采集樣品的紅外光譜曲線、液相色譜法實(shí)測樣品中大麻二酚含量、紅外光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理及分析、建立模型、驗(yàn)證模型。本發(fā)明基于中紅外光譜技術(shù)，結(jié)合PLS模型的預(yù)測能力和主成分分析的區(qū)分效果，可以對工業(yè)大麻提取物產(chǎn)品、花葉中的大麻二酚含量進(jìn)行快速檢測。信息量簡潔豐富，且采用無損鑒別，操作簡單，綠色環(huán)保，性能可靠，具有較低的相關(guān)耗材和維修成本，降低了運(yùn)行成本和環(huán)保風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省大量的人力、物力、財(cái)力，適合推廣使用。為快速測定不同工業(yè)大麻產(chǎn)品的大麻二酚含量提供了一種新方法。
權(quán)利要求書
1.一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，其特征在于：該方法步驟流程包括：
(1)采集樣品的紅外光譜曲線；
(2)對步驟(1)得到的紅外光譜曲線進(jìn)行預(yù)處理，得到排除噪音干擾的中紅外光譜數(shù)據(jù)；
(3)測定樣品中大麻二酚含量；
(4)將步驟(3)得到的大麻二酚含量數(shù)據(jù)與步驟(2)得到的中紅外數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸建模得到大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型；
(5)檢測待測定樣品的紅外光譜曲線，代入步驟(4)得到的大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型中，得到待檢測樣品的大麻二酚含量，完成所有檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，其特征在于：步驟(2)中預(yù)處理方法包括多元散射校正、偏差校正、平滑處理、變量標(biāo)準(zhǔn)化、一階導(dǎo)數(shù)處理、二階導(dǎo)數(shù)處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，其特征在于：步驟(4)所述的建模方法是指利用中紅外光譜儀和超高效液相色譜兩種高精密儀器所測得數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，首先將步驟(2)的中紅外光譜數(shù)據(jù)，將其作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的預(yù)測值，再使用超高效液相色譜儀檢測同批樣品的大麻二酚含量，液相色譜所測數(shù)據(jù)作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的真實(shí)值，之后將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸建模，便可得到工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
工業(yè)大麻是在中國傳統(tǒng)種植的“火麻”或稱“漢麻”，基礎(chǔ)上培育的，植物干花葉中化學(xué)成分△9 四氫大麻酚含量小于0.3％Wt，可針對纖維用、籽用或花葉提取等工業(yè)應(yīng)用的低毒大麻品種。其中以大麻二酚為代表的大麻素類化學(xué)物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁、抗精神病、抗炎、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等多種藥理活性，近年來對工業(yè)大麻花葉中的藥用成分提取加工和應(yīng)用開發(fā)也非常多，因此國內(nèi)外種質(zhì)研發(fā)機(jī)構(gòu)紛紛研究和生產(chǎn)出多種高大麻二酚、低△9 四氫大麻酚含量的工業(yè)大麻產(chǎn)品，其中，全譜油作為一種典型的工業(yè)大麻提取物產(chǎn)品，它包含多種活性成分，這些成分共同作用產(chǎn)生了全譜油獨(dú)特的藥理活性，因其廣泛的健康益處在醫(yī)藥、保健品行業(yè)而備受青睞，所以市面上也催生出了很多的全譜油假冒偽劣產(chǎn)品。本發(fā)明專利的目的在于研究工業(yè)大麻和衍生產(chǎn)品的紅外光譜特性，建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便的工業(yè)大麻產(chǎn)品、品種鑒別方法。
中紅外光譜分析技術(shù)作為一種快速檢測技術(shù)具有分析時(shí)間短、操作簡單、分析成本低等優(yōu)勢，近年來在食品藥品的質(zhì)量分析、真假鑒定和產(chǎn)地鑒別等方面應(yīng)用越來越廣泛。本發(fā)明對工業(yè)大麻提取全譜油、花葉泡酒和工業(yè)大麻花葉的紅外光譜特性進(jìn)行了研究，利用紅外光譜技術(shù)和數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行大麻二酚含量的預(yù)測和主成分分析。采用本研究的紅外快檢技術(shù)可對不同樣品進(jìn)行快速區(qū)分和CBD含量的快速定量，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
目前檢測大麻二酚含量常用的方法通常是液相色譜法(HPLC)或液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)分析，這些方法存在成本較高(流動(dòng)相消耗多且存在環(huán)境污染，維護(hù)成本大)、分析時(shí)間長、檢測量小等問題，但使用本發(fā)明提供的方法剛好可以解決這些問題，本發(fā)明使用便攜式紅外光譜分析儀進(jìn)行測定，設(shè)備維護(hù)簡單，檢測方法快速、簡便，并且有效避免了液相色譜或質(zhì)譜檢測過程中使用流動(dòng)相對環(huán)境造成的污染。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有大麻二酚在檢測過程中存在的問題，本發(fā)明提供另一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，該方法步驟流程包括：
(1)采集樣品的紅外光譜曲線。
(2)對步驟(1)得到的紅外光譜曲線進(jìn)行預(yù)處理，得到排除噪音干擾的中紅外光譜數(shù)據(jù)。
(3)測定樣品中大麻二酚含量。
(4)將步驟(3)得到的大麻二酚含量數(shù)據(jù)與步驟(2)得到的中紅外數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸建模得到大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型。
(5)檢測待測定樣品的紅外光譜曲線，代入步驟(4)得到的大麻二酚含量的中紅外預(yù)測模型中，得到待檢測樣品的大麻二酚含量，完成所有檢測。
優(yōu)選的，步驟(1)中，當(dāng)樣品為液體時(shí)取0.1克溶解于2mL75％乙醇溶劑中，超聲處理15min，取50uL于2毫米厚溴化鉀壓片上，再將另一個(gè)壓片壓上去作為背景，然后放置到檢測窗口待測得到樣品的紅外光譜曲線。
優(yōu)選的，步驟(1)中，當(dāng)樣品為固體時(shí)，將樣品清洗、烘干、粉碎、過篩，稱取過篩得到粉末樣品0.1克，均勻平鋪于測試臺(tái)上檢測得到樣品的紅外光譜曲線。
優(yōu)選的，步驟(1)中中紅外光譜的采集條件為：掃描范圍700～3800cm 1，每個(gè)樣品采集3次。中紅外光譜分析儀為美國安捷倫ATR Cary 630FTIR便攜式光譜儀，數(shù)據(jù)采集軟件為Agilent MicroLab PC Software。
優(yōu)選的，步驟(2)中數(shù)據(jù)處理軟件為Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，經(jīng)預(yù)處理后剔除異常樣品數(shù)據(jù)，獲得工業(yè)大麻不同樣品的排除噪音干擾的中紅外光譜曲線。紅外光譜預(yù)處理的方法包括多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)、偏差校正(Deviation correction)、平滑處理、變量標(biāo)準(zhǔn)化、一階導(dǎo)數(shù)處理、二階導(dǎo)數(shù)處理。
優(yōu)選的，步驟(3)中大麻二酚含量通過超高效液相色譜Agilent Technologies 1290 Infinity測得。
優(yōu)選的，步驟(4)所述的建模方法是指利用中紅外光譜儀和超高效液相色譜兩種高精密儀器所測得數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，首先將步驟(2)的中紅外光譜數(shù)據(jù)，將其作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的預(yù)測值，再使用超高效液相色譜儀檢測同批樣品的大麻二酚含量，液相色譜所測數(shù)據(jù)作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的真實(shí)值，之后將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸建模，建模軟件為Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，便可得到工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
本發(fā)明的有益效果
(1)該方法操作簡單，在建立模型之后，只需對操作人員簡單培訓(xùn)即可，光譜數(shù)據(jù)帶入模型即可直接得到結(jié)果，無需專業(yè)人員，檢測速度快，檢測成本低廉，很適合推廣應(yīng)用。
附圖說明
圖1為工業(yè)大麻的中紅外原始光譜圖。
圖1
圖2為光譜預(yù)處理圖，其中(1)為多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)；(2)為偏差校正(Deviation correction)；(3)為平滑處理(SG)；(4)為變量標(biāo)準(zhǔn)化(SNV)；(5)為一階導(dǎo)數(shù)處理；6.二階導(dǎo)數(shù)處理。
圖2
圖3為工業(yè)大麻主成分分析圖，其中(1)為2種工業(yè)大麻產(chǎn)品和花葉(花葉提取全譜油、花葉泡酒、工業(yè)大麻花葉)的主成分分析圖；(2)為三種全譜油產(chǎn)品主成分分析圖；(3)為三種花葉的主成分分析圖。
圖3
圖4為不同區(qū)域工業(yè)大麻的聚類分析圖。
圖4
圖5為工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
圖5
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。但下述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
實(shí)施例中使用的儀器：安捷倫ATR Cary630 FTIR便攜式光譜儀；超高效液相色譜Agilent Technologies 1290 Infinity；數(shù)據(jù)處理軟件：Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1；MetaboAnalyst5.0。
下列實(shí)施方式中，根據(jù)中紅外掃描數(shù)據(jù)以及液相色譜測定數(shù)據(jù)建立模型。實(shí)驗(yàn)所用樣品包括工業(yè)大麻提取全譜油、花葉泡酒和工業(yè)大麻花葉，均由云南工業(yè)大麻種植加工企業(yè)和云南工業(yè)大麻協(xié)會(huì)提供。
實(shí)施例1
一種中紅外光譜預(yù)測模型的建立，具體步驟如下所述：
(1)采集檢測樣品的中紅外光譜曲線：
A.將工業(yè)大麻提取全譜油、工業(yè)大麻花葉泡酒各取0.1克溶解于2mL75％乙醇溶劑中，超聲處理15min，待用。
B.將步驟(A)處理后的工業(yè)大麻提取全譜油和工業(yè)大麻花葉泡酒樣品使用移液槍分別滴50uL于溴化鉀壓片上，再將另一個(gè)背景壓片壓上去，然后放置到檢測窗口測試，每個(gè)樣品重復(fù)三次，
C.工業(yè)大麻花葉樣品前處理方法為清洗、烘干、粉碎、過篩。稱取過篩得到花葉粉末樣品0.1克，均勻平鋪于測試臺(tái)準(zhǔn)備待測，檢驗(yàn)時(shí)間為30秒，每個(gè)樣品重復(fù)三次，每次測樣后均用95％酒精擦拭檢測窗口。
得到的中紅外原始光譜圖如圖1所示。
(2)對步驟(1)得到的中紅外原始光譜圖進(jìn)行預(yù)處理，得到排除噪音干擾的中紅外光譜數(shù)據(jù)，具體為將步驟(1)得到的每個(gè)樣品的3個(gè)重復(fù)中紅外原始光譜圖進(jìn)行散射校正和預(yù)處理，包括多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)、偏差校正(Deviation correction)、平滑處理(SG)、變量標(biāo)準(zhǔn)化(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)處理、二階導(dǎo)數(shù)處理，處理結(jié)果如圖2所示，其中圖2(1)為多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)結(jié)果；圖2(2)為偏差校正(Deviation correction)處理結(jié)果；圖2(3)為平滑處理結(jié)果；圖2(4)為變量標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果；圖2(5)一階導(dǎo)數(shù)處理；圖2(6)二階導(dǎo)數(shù)處理。
(3)測定樣品中大麻二酚含量：采用超高效液相色譜測定樣品中大麻二酚含量，具體步驟為：
A.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
稱取1ml濃度1000ug/ml的大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液至10ml容量瓶中，并定容至刻度線，制得200ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并放置在 20℃下的冰箱內(nèi)避光冷藏待用，后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分析設(shè)置5個(gè)不同梯度進(jìn)樣(0.2μL，0.5μL，1μL，2μL，5μL)。
B.樣品分析
稱量工業(yè)大麻花葉粉末樣品0.2g，使用95％甲醇 水溶液提取，定容10mL，超聲30min，12000r/min離心5min，取出上清液，過0.22μm的有機(jī)系濾膜過濾，再將濾液轉(zhuǎn)移至色譜進(jìn)樣瓶中上機(jī)分析。HPLC條件設(shè)置：Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流動(dòng)相A為0.1％磷酸水溶液，B為甲醇溶液，等度洗脫：75％B，流速0.30ml/min，色譜柱溫：30℃；進(jìn)樣量設(shè)置為1μL。并考察所檢測樣品處理液濃度是否在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，若不在，需稀釋或濃縮樣品處理液。
C.樣品含量計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積作為y，并與其相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行回歸分析，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝6.9806x 3.6129，R2＝0.9997。再根據(jù)峰面積之比對于濃度之比，即可算出大麻二酚的實(shí)際含量，所有樣品大麻二酚的實(shí)際含量如表1所示。
表1 樣品中大麻二酚含量的實(shí)測結(jié)果
(4)將步驟(2)得到的中紅外光譜數(shù)據(jù)，將其作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的預(yù)測值，再使用超高效液相色譜儀檢測同批樣品的大麻二酚含量，液相色譜所測數(shù)據(jù)作為偏最小二程回歸分析預(yù)測模型的真實(shí)值，之后將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸建模，建模軟件為Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，便可得到工業(yè)大麻中大麻二酚含量中紅外光譜預(yù)測模型。
對不同條件下建立的模型進(jìn)行比較，選擇定標(biāo)模型交叉驗(yàn)證偏差(SEC)小，預(yù)測均方根誤差(RMSE)小，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R大的模型。對不同條件下建立的模型進(jìn)行比較，選擇定標(biāo)模型交叉驗(yàn)證偏差(SEC)小，預(yù)測均
方根誤差(RMSE)小，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R大的模型。不同處理?xiàng)l件的比較如表2所示。最終選擇MSC+SG+SNV+2階求導(dǎo)，所得線性方程為y＝0.97647612*x+0.01719390。
表2 不同處理方法
實(shí)施例2
模型準(zhǔn)確性預(yù)測
將待檢測的工業(yè)大麻樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到中紅外預(yù)測模型當(dāng)中，如圖5所示，篩選出其中不同產(chǎn)地的工業(yè)大麻所得結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并將這些數(shù)據(jù)分為校正集和驗(yàn)證集，通過內(nèi)部交叉驗(yàn)證的方式對模型的預(yù)測能力進(jìn)行驗(yàn)證，分別計(jì)算出每一個(gè)校正集和驗(yàn)證集的準(zhǔn)確率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以及交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(R2)、殘差，最后求平均值，結(jié)果如表3所示。準(zhǔn)確率越高、相關(guān)系數(shù)越大說明模型預(yù)測效果越好，所有校正集和驗(yàn)證集準(zhǔn)確率均在80％以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于28％，表明該模型可以成功使用。
相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD計(jì)算公式為
驗(yàn)證集、校正集的準(zhǔn)確率(A)計(jì)算公式為
將預(yù)測模型所計(jì)算出的每一個(gè)校正集、驗(yàn)證集的預(yù)測含量導(dǎo)入EXCEL表格中，利用STDEV函數(shù)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，代入RSD計(jì)算公式即可得到RSD值。
準(zhǔn)確率計(jì)算公式中，|V|為每個(gè)樣品點(diǎn)殘差的絕對值。|P|為每個(gè)樣品點(diǎn)的預(yù)測值。殘差等于液相色譜所測的真實(shí)值減去預(yù)測模型所測的預(yù)測值，計(jì)算出每一個(gè)驗(yàn)證集、校正集的準(zhǔn)確率后，再求平均值，最終所得結(jié)果作為模型準(zhǔn)確率判斷依據(jù)。
表3 PLS模型的準(zhǔn)確率及RSD值(工業(yè)大麻花葉樣品)
為進(jìn)一步驗(yàn)證紅外光譜檢測的準(zhǔn)確性，我們將實(shí)施例1中步驟(1)所得的原始光譜數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入主成分分析模型(PCA)中，分析是否可以有效區(qū)分不同品種。結(jié)果表明，該模型對于品種區(qū)分效果良好，可有效判別工業(yè)大麻不同品種，但缺點(diǎn)是無法對大麻二酚含量進(jìn)行定量，結(jié)果如圖3所示，圖3(1)區(qū)分出了兩類工業(yè)大麻產(chǎn)品和花葉的區(qū)別(全譜油、工業(yè)大麻花葉泡酒杜、工業(yè)大麻花葉)。圖3(2)區(qū)分出了同種全譜油但不同含量的區(qū)別。圖3(3)區(qū)分出了工業(yè)大麻不同品種的區(qū)別(云麻7號、云麻8號、云麻10號)。該模型可證明紅外光譜檢測的準(zhǔn)確性，同時(shí)可為工業(yè)大麻產(chǎn)品真假鑒別、品種區(qū)分提供一種依據(jù)。
根據(jù)實(shí)施例1中步驟(1)所得的原始光譜數(shù)據(jù)，還可對產(chǎn)地來源進(jìn)行驗(yàn)證，方法是通過建立聚類分析模型，可明顯區(qū)分出工業(yè)大麻6個(gè)產(chǎn)地的區(qū)別(楚雄、曲靖、尋甸、玉溪、保山、昆明、倘甸)，區(qū)分效果明顯、結(jié)果準(zhǔn)確，同時(shí)可為產(chǎn)地溯源提供依據(jù)，模型如圖4所示。
實(shí)施例3真實(shí)值與預(yù)測值的比較
使用超高效液相色譜法檢測樣品的大麻二酚含量作為真實(shí)值，中紅外光譜預(yù)測模型為預(yù)測值，全譜油樣品的CBD含量預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差為4.94，標(biāo)準(zhǔn)誤差為1.71，花葉酒的CBD含量預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差為0.02，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.01，工業(yè)大麻花葉的CBD含量預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差為0.29，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.016，所有樣品的交叉驗(yàn)證系數(shù)均大于0.9，表明模型可以成功使用。工業(yè)大麻樣品中的大麻二酚含量的真實(shí)值與預(yù)測值的比較如表4所示。
表4 22個(gè)樣品詳細(xì)信息
模型應(yīng)用
對待檢測樣品進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相關(guān)性圖見如圖5所示，全樣品預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值的R均達(dá)到0.9以上，具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確性，說明模型可用于大麻花葉中大麻二酚含量的快速測定和初步篩選。
文章摘自國家發(fā)明專利，一種基于中紅外光譜預(yù)測模型快速測定大麻二酚含量的方法，發(fā)明人:李曉蕾，張浩，蔡尤西，張瑞婷，江茜，申請?zhí)?/font>:202411427449.6，申請日:2024.10.14。
