摘  要：研究儲存時間、溫度等條件對羅布麻葉黃酮類成分穩(wěn)定性的影響，為提取和貯存提供科學(xué)依據(jù)。方法通過紫外分光光度法測定在光照、儲存時間、溫度、pH、氧化物、還原物、金屬離子及食品添加劑各條件下總黃酮的吸光度值，分析各條件對總黃酮穩(wěn)定性的影響。結(jié)果總黃酮在避光下，貯藏10天無明顯變化；60℃～80℃溫度提取較完全并在弱酸條件下穩(wěn)定；H₂O₂、蔗糖、苯甲酸對羅布麻葉中總黃酮穩(wěn)定性無影響；Na₂SO₃、檸檬酸、抗壞血酸可能會破壞黃酮結(jié)構(gòu)影響穩(wěn)定性；當(dāng)羅布麻葉黃酮類成分遇到Fe³⁺時會不穩(wěn)定。結(jié)論羅布麻葉黃酮類成分在提取和貯藏過程中，避免接觸過堿性物質(zhì)、Na₂SO₃和鐵類容器，食品添加劑可選擇蔗糖。

關(guān)鍵詞：羅布麻葉；黃酮；穩(wěn)定性；紫外分光光度

 

羅布麻葉來源于夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉，又名野麻、野茶等，是一味藥食同源中藥，具有平肝陽、安心神、清熱利尿之功效。研究發(fā)現(xiàn)，羅布麻葉主要活性成分為黃酮類化合物，具有降血壓、抗氧化、抗抑郁、抗焦慮和降低膽固醇等多種藥理活性^[1]。作為鹽生植物，羅布麻主要分布于灘涂濕地及河流湖泊沿岸的黃河三角洲一帶，是該地區(qū)典型的具有較高經(jīng)濟(jì)價值的藥用鹽生植物資源。

近年來，許多學(xué)者對不同中藥、食品中黃酮類化合物的穩(wěn)定性開始研究。穩(wěn)定性研究作為藥品質(zhì)量控制研究的主要內(nèi)容之一，其與藥品的質(zhì)量研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立有著密切的聯(lián)系，并且具有持久性特點(diǎn)，在藥物臨床研究期間和上市后，需要繼續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定性相關(guān)考察。因此，對羅布麻中黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性開展研究，一方面可以提高黃酮類有效成分的利用率，另一方面也會為后期藥材提取及儲存提供科學(xué)參考。

 

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻葉，購于通化醫(yī)藥大廈，經(jīng)秦汝蘭副教授鑒定為羅布麻正品；乙醇、鹽酸、亞硫酸鈉、蔗糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鋁、氯化鐵、硝酸鋁、雙氧水、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、抗壞血酸、苯甲酸鈉、檸檬酸，分析純，均購于天津市康科德科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA1004，上海友聲衡器有限公司）；超聲儀器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；酸度計（pHS-25，廣州力辰邦西儀器科技有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-1200，廣州精科儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 羅布麻葉總黃酮的提取方法

羅布麻葉粉碎至粉末，過三號篩。取約為0.5g的粉末，稱重，放入具塞的100mL錐形瓶中，再精密加入50%甲醇50mL，稱重并記錄數(shù)據(jù)，超聲40min，冷卻后補(bǔ)足重量。棄去前幾滴濾液，取續(xù)濾液，即為黃酮粗提取液，待用^[2]。

1.3.2 羅布麻葉總黃酮的檢測方法

用移液管吸取0.3mL黃酮粗提液加入干燥潔凈的2mL容量瓶中，并用70%乙醇定容。再將定容后的2mL溶液移至干燥潔凈的試管中，加入0.3mL的5%NaNO₂，搖勻，靜置充分反應(yīng)6min，再加入0.3mL的10%Al(NO₃)₃，搖勻，靜置充分反應(yīng)6min，最后加入3mL10%NaOH，搖勻，充分反應(yīng)15min后取適量液體至比色皿中，放入已校準(zhǔn)基線的紫外分光光度計中，在510nm處的波長下測量吸光度值，記錄數(shù)據(jù)^[3]。

1.3.3 羅布麻葉總黃酮的穩(wěn)定性影響因素考察

1.3.3.1 以光照為實驗影響因素

取干燥潔凈的試管，并標(biāo)記為光照組和避光組，之后向其中加入等量總黃酮粗提液，光照組置于陽光下開始光照，避光組放置在陰暗避光條件下，每隔1h開始取樣（實驗時間5h，共取樣5次），使用紫外分光光度計測定樣品吸光度值，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[4，5]。

1.3.3.2 以儲存時間為實驗影響因素

按“1.3.1”項下方法制備樣品溶液并置于冰箱中冷藏保存10天，每天取粗提液少許，按“1.3.2”項下方法測定粗提液中總黃酮的吸光度值，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[6]。

1.3.3.3 以溫度為影響因素

取0.5g羅布麻葉粉末5份，按“1.3.1”項下方法在20℃~100℃5個不同溫度下制備樣品溶液，按“1.3.2”項下方法測定粗提液中總黃酮的吸光度值，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[7]。

1.3.3.4 以pH值為影響因素

用稀釋后的酸、堿試劑配置1～12個不同pH值的蒸餾水，再向不同pH值蒸餾水中加入等量的總黃酮粗提液，將12支試管置于室溫下靜置0.5h，然后各取0.3mL作為待測液，按檢測方法測定吸光度值，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[8]。

1.3.3.5 以氧化物為影響因素

為保證安全，H₂O₂的濃度在食品中用量限制在2%以內(nèi)，因此，以30%的H₂O₂配制濃度梯度為0.2%～1.6%的8組含相同濃度總黃酮粗提液的H₂O₂溶液。搖勻后靜置0.5h，依據(jù)總黃酮檢測方法開始檢測，記錄數(shù)值，整理并繪圖，以70%的H₂O₂為空白試劑^[9，10]。

1.3.3.6 以還原物為影響因素

為保證安全，Na₂SO₃的濃度在食品中的用量限制在0.05%以內(nèi)，因此，該實驗配制等濃度梯度的6組Na₂SO₃溶液（0%~0.05%），且各組加入等濃度總黃酮粗提液，搖勻后在室溫下靜置0.5h，依據(jù)總黃酮檢測方法開始檢測，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[11]。

1.3.3.7 以金屬離子為影響因素

分別取含K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺5種不同的金屬離子試劑，向總黃酮粗提取液中加入配制完成的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的金屬離子試劑，其濃度梯度設(shè)置為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%，各濃度下金屬離子溶液靜置0.5h，再依據(jù)總黃酮檢測方法開始檢測，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[13]。

1.3.3.8 以食品添加劑為影響因素

取蔗糖、抗壞血酸、檸檬酸食品添加劑及苯甲酸鈉防腐劑，向總黃酮粗提液中分別加入上述不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的4種食品添加劑，其濃度梯度設(shè)置為0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，各濃度下的溶液靜置0.5h，按總黃酮檢測方法開始檢測，記錄數(shù)值，整理并繪圖^[13]。

 

2 結(jié)果與分析

2.1 光照條件對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性的影響

  

圖1 光照和避光條件下總黃酮吸光度值變化

由圖1可知，在光照環(huán)境下，粗提液中總黃酮吸光度值有降低趨勢，并且光照條件下的總黃酮吸光度值均低于避光保存下總黃酮吸光度值，其原因可能是光照環(huán)境會促進(jìn)黃酮類化合物發(fā)生降解或氧化，穩(wěn)定性變差。因此，為保證羅布麻葉黃酮的穩(wěn)定存放，建議在貯存時避免陽光直曬^[14]。

2.2 儲存時間對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖2 不同儲存時間總黃酮吸光度值

從圖2可以看出，總黃酮吸光度值在儲存10天內(nèi)無明顯變化，但為了避免黃酮類化合物由于儲存時間過久而發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化，建議實驗過程中隨配隨用，不宜放置時間較長^[15]。

2.3 不同溫度對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖3 不同溫度總黃酮吸光度值

圖3表明，不同溫度對總黃酮吸光度值影響較明顯，提取溫度為20℃時，總黃酮吸光度值較低，可能在此溫度下，藥材中的黃酮類物質(zhì)未完全從細(xì)胞壁中溶出，隨著提取溫度的升高，總黃酮吸光度值不斷上升且80℃時總黃酮吸光度值最高，說明此溫度下藥材中的黃酮類物質(zhì)提取最完全，當(dāng)溫度不斷上升時總黃酮吸光度值迅速降低，其原因可能為高溫時黃酮類化合物不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，羅布麻葉總黃酮在提取時，溫度宜在80℃時進(jìn)行，溫度過低或過高都會對提取效率產(chǎn)生影響^[16，17]。

2.4 不同pH值對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖4 不同pH值總黃酮吸光度值

由圖4可知，當(dāng)pH≤4.0時，即溶液處于酸性條件下黃酮類成分較穩(wěn)定，隨著溶液pH增大，總黃酮吸光度值開始降低，其原因可能是黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中含有酚羥基呈現(xiàn)酸性，在酸性溶液條件下結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，隨pH上升黃酮類化合物結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，當(dāng)pH≥8時，吸光度值降低幅度最明顯，這也說明在堿性環(huán)境下羅布麻葉中的黃酮類成分破壞最嚴(yán)重。因此，在提取或儲存過程中應(yīng)避免堿性條件^[18]。

2.5 不同濃度氧化物對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖5 不同濃度的氧化物總黃酮吸光度值

由圖5可知，隨著氧化劑雙氧水濃度的增加，總黃酮的吸光度值也隨之降低，但當(dāng)雙氧水濃度不斷增加時，總黃酮的吸光值降低不明顯，說明黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)基本不受雙氧水濃度的影響，這也進(jìn)一步表明了羅布麻葉黃酮類成分具備較好的抗氧化作用。

2.6 不同濃度還原劑對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖6 不同濃度的還原物總黃酮吸光度值

圖6表明，還原劑Na₂SO₃的加入對羅布麻葉中黃酮類成分破壞較嚴(yán)重，總黃酮吸光度值急劇下降，且隨著還原物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，總黃酮吸光度值越低。表明Na₂SO₃對羅布麻葉黃酮穩(wěn)定性有很大的影響，因此羅布麻葉中黃酮成分在生產(chǎn)、儲存過程中都要避免與還原劑接觸^[19]。

2.7 不同濃度5種金屬離子對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖7 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)金屬離子總黃酮吸光度值

圖7顯示，隨著5種金屬離子質(zhì)量濃度的增加，Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Al³⁺離子對總黃酮吸光度值基本沒有影響，表明這些金屬離子對黃酮類成分的穩(wěn)定性影響不大，當(dāng)實驗中添加了Fe³⁺金屬離子時，提取液中出現(xiàn)大量沉淀其吸光度迅速降低。推測其主要原因可能是由于Fe³⁺為過渡金屬離子，并且過渡金屬離子是許多自由基產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，催化脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生。然而黃酮類成分作為一種天然抗氧化劑，通過螯合金屬離子能夠起到較好的抗氧化作用。通過構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)Fe³⁺能與黃酮化合物結(jié)構(gòu)中的鄰二酚羥基官能團(tuán)結(jié)合，形成不溶性絡(luò)合物。因此，Fe³⁺對羅布麻葉中黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性影響最大，在提取和貯存黃酮成分時盡量避免鐵質(zhì)容器^[20-22]。

2.8 不同食品添加劑對羅布麻葉總黃酮穩(wěn)定性影響

  

圖8 不同食品添加劑總黃酮吸光度值

圖8所示為4種添加劑對總黃酮吸光度值的影響，不同濃度苯甲酸鈉的加入對總黃酮的穩(wěn)定性影響不明顯，波動很??；蔗糖的加入與苯甲酸鈉加入后對總黃酮的穩(wěn)定性影響相同，未有明顯變化；抗壞血酸加入后，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.10%時，影響不明顯，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.10%時，總黃酮吸光度值下降趨勢明顯，推測原因可能是抗壞血酸對黃酮類成分起到雙重作用。濃度低時，對黃酮類成分起到穩(wěn)定作用，但濃度高時，則會破壞黃酮類的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黃酮成分降解；檸檬酸的加入對黃酮成分有增色效應(yīng)，在低濃度時現(xiàn)象不明顯，當(dāng)檸檬酸濃度高于0.15%時，增色效應(yīng)越明顯，總黃酮吸光度值呈現(xiàn)快速下降趨勢，這也進(jìn)一步表明當(dāng)檸檬酸濃度過高時，黃酮成分穩(wěn)定性較差。因此，不同調(diào)味劑在中藥中應(yīng)適量添加，過量則會對羅布麻葉中黃酮類成分起到反作用^[23]。

 

3 結(jié)論與討論

本文利用超聲法提取羅布麻葉中總黃酮，并通過紫外分光光度法測定各種實驗條件下總黃酮的吸光度值，探討儲存時間、溫度等條件對黃酮類成分穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示，羅布麻葉中黃酮類成分在提取、儲存過程中應(yīng)放置在陰涼避光處，盡量避免接觸堿性物質(zhì)、Na₂SO₃和鐵類器皿，食品添加劑蔗糖及防腐劑苯甲酸鈉的加入，對黃酮類化合物穩(wěn)定性幾乎沒有影響，但抗壞血酸及檸檬酸的使用要注意濃度^[24]，本文為羅布麻葉黃酮類成分的開發(fā)利用提供了參考和科學(xué)依據(jù)。

 

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文章摘自：王爽,王欣雨,呂重寧,等.羅布麻葉中黃酮的穩(wěn)定性研究[J].人參研究,2025,37(01):47-51.