摘 要: 為了解決大麻二酚酸（CBDA）傳統(tǒng)提取工藝效率低、生長期和光質(zhì)調(diào)控對其含量影響不明確等問題，試驗遵循高效提取、精準(zhǔn)調(diào)控理念，采用響應(yīng)面法優(yōu)化CBDA提取工藝，并考察光質(zhì)調(diào)控“漢麻11號”不同生長期CBDA含量變化。根據(jù)單因素試驗并結(jié)合響應(yīng)面法考察液料比、提取溫度、提取時間和超聲波功率對CBDA含量的影響，確定最佳提取工藝并對理論結(jié)果進行驗證。結(jié)果表明，CBDA最佳提取工藝為液料比50:1（mL/g），提取溫度33℃，提取時間32min，超聲波功率135W，該條件下CBDA百分含量為3.885%，與驗證結(jié)果（3.91±0.07）%基本一致，相比于以往文獻(xiàn)報道方法提升了9.83%。光質(zhì)調(diào)控研究表明，紅色：綠色：藍(lán)色=79.88%：4.01%：16.11%的光質(zhì)條件下，初花期CBDA成分含量最高。該研究為CBDA的光質(zhì)調(diào)控和最佳采收期提供了技術(shù)依據(jù)，有望提高CBDA的應(yīng)用價值。
關(guān)鍵詞:工業(yè)大麻；大麻二酚酸；提取工藝；光質(zhì)調(diào)控；不同生長期；最佳采收期
工業(yè)大麻（Industrial hemp）屬一年生大麻科大麻屬草本植物[1]。大麻二酚（CBD）是工業(yè)大麻中主要的非精神活性成分，近年來國際上對其進行的研究逐漸深入。大麻二酚酸（CBDA）是CBD的生物合成前體，在特殊頻段光照、高溫加熱、儲存過程等條件下發(fā)生脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)變成CBD。研究發(fā)現(xiàn)，CBDA具有降低食欲、減輕體重[2]、治療犬類疾病[3-4]、治療自閉癥[5]、治療精神分裂[6]、保肝[7]等功效，并具有一定的抗病毒活性[8]。
人工光源室內(nèi)栽培植物相比于大田種植，生長環(huán)境穩(wěn)定且可調(diào)控。針對植物生長需求進行光質(zhì)調(diào)控，能夠?qū)崿F(xiàn)形態(tài)建成以及目標(biāo)活性成分的靶向積累。對室內(nèi)栽培植物不同生長期中目標(biāo)成分含量進行監(jiān)測，對確定最佳采收期、合理施肥、質(zhì)量控制以及開發(fā)利用等方面有重要指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值[9-11]。
目前在大麻素成分的分析中，CBD提取方法較為成熟，然而并沒有CBDA的精確提取方法。由于CBDA的穩(wěn)定性較差，在一些條件如：特殊頻段光照、高溫加熱等情況下，可以脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)镃BD[12]，因此CBD提取條件中對溫度、超聲波功率等的要求并不同樣適用于CBDA。為了降低因提取條件導(dǎo)致CBDA脫羧轉(zhuǎn)化造成的含量損失，盡可能精確地分析工業(yè)大麻中CBDA的含量，本文在CBD提取方法的研究基礎(chǔ)上，探究不同液料比、提取溫度、提取時間、超聲波功率下CBDA的提取效果，采用超聲輔助提取并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了CBDA的提取方法，并以此方法對光質(zhì)調(diào)控不同生長期的CBDA含量變化進行測定，明晰CBDA在工業(yè)大麻生長周期中的成分動態(tài)積累過程，明確其成分積累最大值時的生長期，進而確定最佳采收期，為大麻花葉的深入開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
工業(yè)大麻原料由黑龍江省科學(xué)院大慶分院提供；甲醇：色譜純，北京百靈威科技有限公司；乙腈：色譜純，北京百靈威科技有限公司；CBDA標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度100μg/mL，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；甲酸：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22μm針式有機相濾膜：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；10mL一次性注射器：江蘇宇治醫(yī)療器材有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
LC-15C高效液相色譜儀：島津公司；Inertsoil ODS-3（150mm×4.6mm,3μm）色譜柱：島津公司；TDL-80-2B型離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；PTX-FA110型電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；A11-B-S025型粉碎機：德國IKA公司；HP320型光譜照度計：杭州雙色智能檢測儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 取樣方法
2023年7月采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院試驗基地種植的“漢麻11號”植株葉片（花穗），取樣部位為植株主莖頂端葉片（花穗），陰干脫水并4℃條件下保存待測。
1.3.2 供試品溶液的制備
按照文獻(xiàn)記載方法[13-15]，在以往工藝條件上進行微調(diào)。將待測樣品充分研磨粉碎，稱取0.1g置于10mL離心管中，加入5mL甲醇溶液，放置于超聲波清洗器中以150W功率40℃提取30min，然后以轉(zhuǎn)速1000r/min離心2min，充分移取上清液過0.22μm有機相濾膜，置于容量瓶中。重復(fù)提取3次，合并提取液，定容至25mL，即得供試品溶液。
1.3.3 HPLC 檢測方法的建立
（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
用CBDA標(biāo)準(zhǔn)溶液配置出濃度分別為0.6、3、6、30、60μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22μm有機相濾膜后待測。
（2）高效液相色譜條件
色譜柱：Inertsoil ODS-3（150mm×4.6mm,3μm）色譜柱，以V（乙腈）：V（水）=78：22為流動相進行等度洗脫，流速0.7mL/min，檢測波長220nm，柱溫30℃，進樣量10μL，分析時間20min。
1.3.4 方法學(xué)考察
（1）線性關(guān)系試驗
將各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1.3.3（2）”的條件進行HPLC檢測。分別以各標(biāo)準(zhǔn)濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)x，以峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制出CBDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
曲線方程為y=53972x+62.303，R²=0.9998，線性范圍為0.5~100（μg/mL），檢測限（LOD）為0.05μg/mL，定量限（LOQ）為0.15μg/mL。
（2）精密度試驗
將0.6、6、30μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照“1.3.3（2）”的條件分別連續(xù)進樣5次，記錄峰面積。
（3）穩(wěn)定性試驗
將陰干、粉碎后的樣品按照“1.3.2”條件進行供試品溶液的制備，4℃避光條件下保存，分別于制備后的0、1、3、6、10、16、24h按照“1.3.3（2）”的條件進樣，記錄CBDA峰面積。
（4）重復(fù)性試驗
將陰干、粉碎后的樣品8份，按照“1.3.2”條件進行供試品溶液的制備，按照“1.3.3（2）”的條件進樣，記錄CBDA峰面積。
（5）加樣回收率試驗
準(zhǔn)確量取8份已知CBDA含量的供試品溶液10mL，分別加入6μg/mL的CBDA標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL，混合均勻后按照“1.3.3（2）”的條件進樣，記錄CBDA峰面積。
（6）含量計算方法
按公式（1）計算CBDA百分含量Y：
式中：S—峰面積；25—溶劑體積，mL；M—樣品實際干重，g；10000—換算系數(shù)。
1.3.5 單因素試驗
參照1.3.2方法，考察液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1）（mL/g）、提取溫度（20、30、40、50、60℃）、提取時間（10、20、30、40、50min）、超聲波功率（75、90、105、120、135、150W）對CBDA百分含量的影響。
1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗
基于單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert13軟件設(shè)計Box-Behnken Design試驗，以液料比、提取溫度、提取時間、超聲波功率為試驗因素，CBDA百分含量為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗設(shè)計如表1所示。
表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計
1.3.7光質(zhì)調(diào)控不同生長期工業(yè)大麻CBDA含量測定
韋秀葉[16]研究了不同光譜對工業(yè)大麻CBD產(chǎn)量的影響，但并未對CBDA含量進行研究，本文參考其光譜，選擇了4種光質(zhì)調(diào)控條件，并對其影響下不同生長期大麻CBDA含量進行測定。
樣品于2023年7—9月采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院培育的“漢麻11號”品種。Group1~4分別生長于4種光質(zhì)調(diào)控室內(nèi)育種間，使用HP320型光譜照度計檢測光譜（圖1），除光譜不同外，其他培育條件均一致。研究表明[17]，藍(lán)光會延長花葉成熟期，本文4個光質(zhì)中藍(lán)色光占比基本相同，因此沒有對花期和生長階段產(chǎn)生影響。取樣時各光質(zhì)育種間內(nèi)的植株均處于相同的生長階段。監(jiān)測周期從種子萌發(fā)后的第15天開始，第一次取樣時間記錄為0d，此時植株處于苗期，取樣部位為頂端葉片，之后每7天取樣一次，每一個光質(zhì)調(diào)控室內(nèi)育種間取樣30株并進行混合，樣品采集后陰干脫水并4℃條件下保存。取樣時間、部位以及物候期見表2。
表2 取樣時間、部位以及物候期
圖1 4種光質(zhì)調(diào)控室內(nèi)育種間光譜
注：藍(lán)光峰值460nm；綠光峰值530nm；紅光峰值660nm。
將所有待測樣品以響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳條件：液料比50:1（mL/g）、提取溫度33℃、提取時間32min、超聲波功率135W進行超聲波輔助提取，制備供試品溶液。按照“1.3.3（2）”的條件進樣，進行樣品測定，記錄峰面積，計算CBDA含量。
1.3.8 數(shù)據(jù)處理
利用Excel軟件記錄并整理試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以`x±SD（x≥3）表示，運用SPSS27.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Waller-Duncan事后校驗，P＜0.05表示存在顯著性差異。采用Origin2021繪制折線圖、響應(yīng)面圖、柱形圖以及瀑布圖，運用R-studio繪制熱圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 CBDA 液相色譜分析
2.1.1 CBDA 液相色譜分析圖
按照“1.3.3（2）”條件將CBDA標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品進行HPLC分析，如圖2所示。CBDA保留時間為7.731min。在本團隊以往研究中表明，此液相色譜條件可應(yīng)用于工業(yè)大麻花葉提取液的定性及定量分析[18]。
圖2 CBDA 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）色譜圖
2.1.2 方法學(xué)考察
（1）精密度考察
經(jīng)過計算，三種濃度CBDA標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD值分別為0.89%、0.52%、0.72%，證明此方法的精密度良好。
（2）穩(wěn)定性考察
經(jīng)過計算，CBDA峰面積的RSD值為2.48%，證明此方法提取的供試品溶液4℃避光條件下在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。
（3）重復(fù)性考察
經(jīng)過計算，CBDA峰面積的RSD值為3.75%，證明此方法的重復(fù)性良好。
（4）加樣回收率考察
經(jīng)過計算，CBDA平均回收率為98.59%，RSD值為3.98%，證明此方法準(zhǔn)確可靠。
2.2 單因素試驗結(jié)果分析
2.2.1 液料比對 CBDA 百分含量的影響
由圖3可見，液料比在10:1~50:1（mL/g）區(qū)間內(nèi)CBDA百分含量隨液料比的增大呈逐漸上升狀態(tài)，在液料比為50:1（mL/g）時達(dá)到最大值，之后，CBDA百分含量隨液料比的增加呈下降狀態(tài)。推測液料比少于50:1（mL/g）時，CBDA在少量的溶劑中呈現(xiàn)出溶解飽和狀態(tài)，導(dǎo)致樣品中的CBDA未能完全提取，而液料比過高對溶劑需求量更大，會造成不必要的資源浪費[19]。因此，確定液料比為50:1（mL/g）。
圖3 液料比對 CBDA 百分含量的影響
注：各指標(biāo)中不同字母表示差異顯著（P＜0.05），n=3
2.2.2 提取溫度對 CBDA 百分含量的影響
由圖4可見，提取溫度由20℃上升到30℃時，CBDA百分含量有所提高，說明在30℃以下，CBDA未實現(xiàn)充分提取，隨著溫度的升高，CBDA百分含量逐漸降低。由于CBDA的熱穩(wěn)定性較差，高溫易發(fā)生脫羧反應(yīng)[20]。因此，確定30℃為適宜提取溫度。
圖4 提取溫度對 CBDA 百分含量的影響
2.2.3 提取時間對 CBDA 百分含量的影響
由圖5可見，10~30min的提取過程中CBDA百分含量逐漸升高，30~50min的過程中隨著提取時間的加長，CBDA百分含量呈下降趨勢。提取時間太短會導(dǎo)致有效成分未能實現(xiàn)充分提取，在溶液體系達(dá)到平衡后，繼續(xù)超聲波提取不會提高有效成分的溶出，且長時間的超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)會使體系溫度升高，導(dǎo)致CBDA發(fā)生脫羧反應(yīng)，含量降低[21]。因此，確定提取時間為30min。
圖5 提取時間對 CBDA 百分含量的影響
2.2.4 超聲波功率對 CBDA 百分含量的影響
由于功率超過135W后，CBDA百分含量已呈下降趨勢。且有研究表明[22-23]，超聲功率過大會促使CBDA脫羧。因此沒有考慮150W以上的超聲波功率對CBDA百分含量的影響。超聲波功率在75~135W時，CBDA百分含量隨功率增大而上升，135W時達(dá)到百分含量最大值，之后，隨超聲波功率的增大而下降（圖6）。因此，確定超聲波功率為135W。
圖6 超聲波功率對 CBDA 百分含量的影響
2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析
2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果
基于單因素試驗結(jié)果，以液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）和超聲波功率（D）為響應(yīng)變量，以CBDA百分含量（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面法中的Box-Behnken Design試驗方法，設(shè)計4因素3水平試驗，試驗結(jié)果見表3。
表3 Box-Behnken Design 試驗設(shè)計及結(jié)果
2.3.2 回歸方程擬合方差分析
運用Design-Expert13軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得二次方程模型：CBDA百分含量Y=3.83—0.0183A+0.2536B+0.1232C+0.0144D+0.0123AB—0.1751AC+0.0274AD+0.0507BC+0.1566BD—0.2257CD—0.7408A²—0.4341B²—0.3884C²—0.263D²。
回歸方程的分析結(jié)果見表4。P＜0.0001，可知模型極顯著；失擬項P＝0.0656＞0.05，失擬項不顯著；決定系數(shù)R2＝0.972，調(diào)整后的決定系數(shù)R2Adj＝0.9441，可知回歸方程的相關(guān)性較好，擬合度良好，證明該試驗方法可靠性和可信度較高，可以應(yīng)用該模型來預(yù)測和分析大麻中CBDA的百分含量。由表中F值可以看出，4個因素對樣品中CBDA百分含量的影響程度為：提取溫度（B）＞提取時間（C）＞液料比（A）＞超聲波功率（D）。方程一次項中對大麻中CBDA百分含量的影響，提取溫度（B）達(dá)到了極顯著水平（P＜0.0001），提取時間（C）達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），可知提取溫度對樣品中CBDA百分含量的影響較大，提取時間次之；在兩兩交互項中AC和CD項極顯著（P＜0.01），BD項顯著（P＜0.05），可知液料比和提取時間、提取時間和超聲波功率兩兩交互作用對樣品中CBDA百分含量的影響較大，提取溫度和超聲波功率兩兩交互作用次之；A2、B2、C2、D2這4個二次項對樣品中CBDA百分含量的影響均極顯著（P＜0.0001）。
表 4 回歸方程方差分析
注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
2.3.3 響應(yīng)面分析
因素之間兩兩相互作用對響應(yīng)值產(chǎn)生的影響可以通過響應(yīng)面圖形的形狀直觀地呈現(xiàn)出來，響應(yīng)面的曲度越大，其投影出的二維等高線橢圓的離心率越大，此兩兩因素的交互作用對于響應(yīng)值的影響越顯著[24]。由圖7可見，AC、BD、CD兩兩交互形成的響應(yīng)面曲度較大，坡面陡峭，等高線皆呈橢圓形，證明AC、BD、CD這三組兩兩交互作用對工業(yè)大麻中CBDA百分含量的影響較大，結(jié)論與“2.3.2”中回歸方程方差分析的結(jié)果相一致。
圖7 各因素的交互作用對 CBDA 百分含量的影響
2.3.4 最佳工藝參數(shù)
利用Design-Expert13軟件對工業(yè)大麻中CBDA的提取工藝進行優(yōu)化，通過數(shù)據(jù)分析，得到最佳工藝參數(shù)為：液料比49.706:1（mL/g），提取溫度33.1℃，提取時間31.732min，超聲波功率135.648W，在此條件下樣品中CBDA百分含量為3.885%。考慮實際操作的限制，將工藝參數(shù)進行調(diào)整：液料比50:1（mL/g），提取溫度33℃，提取時間32min，超聲波功率135W，以此條件對樣品中CBDA進行5次平行提取試驗，得到的提取率為（3.91±0.07）%，誤差率為0.64%，證明該法可靠。
2.4 光質(zhì)調(diào)控不同生長期工業(yè)大麻中 CBDA 含量
在以響應(yīng)面法優(yōu)化了分析過程中CBDA提取方法的基礎(chǔ)上，對光質(zhì)調(diào)控不同生長期工業(yè)大麻CBDA含量進行分析。
CBDA是CBD的生物合成前體，在特殊頻段光照、高溫加熱等情況下，可脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)镃BD。因此，在對工業(yè)大麻中CBD含量進行評估時應(yīng)同時分析CBD與CBDA的含量。由圖8可知，Group1光質(zhì)條件下35d取樣的工業(yè)大麻中CBDA含量最高，為6.20%，顯著高于其他光質(zhì)條件和生長期（P＜0.05），其次為與35d取樣時間前后間隔各7d的28d（生長期）和42d（盛花期）樣品，CBDA含量分別為5.52%和5.67%，顯著高于其他光質(zhì)條件和生長期（P＜0.05）。
圖8 CBDA 含量
CBDA是CBD的生物合成前體，在特殊頻段光照、高溫加熱等情況下，可脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)镃BD。因此，在對工業(yè)大麻中CBD含量進行評估時應(yīng)同時分析CBD與CBDA的含量。由圖8可知，Group1光質(zhì)條件下35d取樣的工業(yè)大麻中CBDA含量最高，為6.20%，顯著高于其他光質(zhì)條件和生長期（P＜0.05），其次為與35d取樣時間前后間隔各7d的28d（生長期）和42d（盛花期）樣品，CBDA含量分別為5.52%和5.67%，顯著高于其他光質(zhì)條件和生長期（P＜0.05）。
將CBDA含量進行聚類熱圖分析，由圖9可見，各組測試結(jié)果分為三類，Group3的14d和Group1的21、28、35、42d這五組樣品歸為第一類，CBDA含量顯著高于其他樣品，其中Group1的28、35、42d樣品CBDA含量又顯著高于Group3的14d和Group1的21d樣品。
圖9 CBDA 含量聚類分析熱圖
對各光質(zhì)條件分別進行不同生長期CBDA含量分析與對比，由圖10可見，Group1光質(zhì)條件下整個生長周期內(nèi)CBDA含量的積累明顯高于其他三種光質(zhì)條件，且圖9聚類分析熱圖顯示，成分含量最高的分類中三組試驗數(shù)據(jù)均來自于Group1，圖8也可明顯看出Group1光質(zhì)條件下CBDA含量相較于其他三種光質(zhì)條件的顯著性。
圖10Group1（A）、Group2（B）、Group3（C）、Group4（D）不同生長期CBDA含量
3 討論與結(jié)論
近年來對大麻素的研究主要圍繞CBD展開，CBDA作為其生物合成前體，具有與之相似的功效，如抗炎、抗驚厥、止吐等[25]。但在BologninI等[26]的研究中發(fā)現(xiàn)，在抑制由毒素或運動引起的嘔吐與驚厥反應(yīng)方面，CBDA較CBD效果更佳。隨著研究的不斷深入，CBDA的應(yīng)用前景將會非常廣闊。本文基于CBD分析過程中提取方法研究基礎(chǔ)，采用超聲輔助提取結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了CBDA的提取方法。最佳工藝參數(shù)為：液料比50：1（mL/g），提取溫度33℃，提取時間32min，超聲波功率135W，利用此方法測試的CBDA量為(3.91±0.07)%，較文獻(xiàn)記載方法[13]提升了9.83%。本研究不僅提高了CBDA的提取量，且降低了對提取溫度和超聲波功率的要求，更為節(jié)能和降低機器損耗。
郭孟璧等[27]采用紅、黃、藍(lán)和無色透明濾光膜對工業(yè)大麻進行處理并分析不同時期花葉中CBD含量，發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)調(diào)控下CBD含量各不相同，證明光質(zhì)調(diào)控能夠影響工業(yè)大麻中大麻素的成分積累。本文運用優(yōu)化后的提取工藝對光質(zhì)調(diào)控不同生長期工業(yè)大麻CBDA含量進行比較分析，結(jié)果表明，4組光源中三色比為紅色：綠色：藍(lán)色=79.88%：4.01%：16.11%的光質(zhì)條件下，CBDA成分積累最大，而此光質(zhì)條件與其他三組的明顯區(qū)別在于其綠色光占比極少，紅、藍(lán)光占比較多。工業(yè)大麻是喜陽植物[27]，這與研究表明“紅、藍(lán)光更適于喜陽植物，藍(lán)、綠光更適于喜蔭植物的生長發(fā)育”的結(jié)論一致[28]，推測紅、藍(lán)光能夠促進CBDA的成分積累。在此光質(zhì)條件下種子萌發(fā)后第35天初花期時CBDA含量最高，而初花期后CBDA含量的下降，可能是植株的繼續(xù)生長過程中，大麻素成分由CBDA向CBD進行了轉(zhuǎn)化。LISA等[24]將工業(yè)大麻生長期分為營養(yǎng)期、芽期、盛花期和種子成熟期4個階段，并進行了CBDA含量的測定，研究顯示，芽期和盛花期CBDA含量顯著高于其他兩個階段。本文研究結(jié)果與之一致，且更為細(xì)致地劃分了生長期，并明晰了CBDA含量最高的生長階段為初花期。因此，“漢麻11號”室內(nèi)栽培光質(zhì)條件為紅藍(lán)光比5：1，并在種子萌發(fā)后第35天初花期進行花葉采收，可確保CBDA成分含量最高。
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文章摘自:石雨，李國巍，張婧如，田媛，張治國，高寶昌．工業(yè)大麻中大麻二酚酸（CBDA）含量測定方法優(yōu)化及光質(zhì)調(diào)控分析[J/OL]．中國麻業(yè)科學(xué).https://link.cnki.net/urlid/43.1467.S.20250220.1919.004。
