摘  要：CsMIXTA在調(diào)控大麻雌性花器官中腺毛的發(fā)生和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為了研究CsMIXTA基因的表達調(diào)控，對CsMIXTA基因上游2199bp啟動子序列進行了克隆。通過PlantCARE預測發(fā)現(xiàn)，該啟動子序列具有多個脅迫響應(yīng)元件與光響應(yīng)元件。根據(jù)預測的響應(yīng)元件分布情況，擴增獲得5個5′端缺失的啟動子片段。用克隆的啟動子全長和缺失片段分別構(gòu)建融合GUS基因的表達載體，并將其瞬時轉(zhuǎn)化到煙草葉片和工業(yè)大麻糖葉中。通過GUS染色觀察發(fā)現(xiàn)，CsMIXTA啟動子的核心區(qū)域位于-393~-99bp之間，包含赤霉素響應(yīng)元件TATC-box和轉(zhuǎn)錄起始元件TATA-box。通過LUC熒光素酶表達發(fā)現(xiàn)，CsMIXTA啟動子的核心區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄活性。并且研究還發(fā)現(xiàn)，CsMIXTA基因在工業(yè)大麻糖葉的腺毛中特異性表達。對啟動子進行脅迫響應(yīng)分析的結(jié)果顯示，低溫、脫落酸(ABA)和赤霉素(GA3)都能增強該啟動子的活性。這些結(jié)果為CsMIXTA基因調(diào)控機制研究奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:工業(yè)大麻；CsMIXTA啟動子；瞬時表達；GA3、ABA處理

 

大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科大麻屬的一年生草本植物，也被稱為工業(yè)大麻、火麻、漢麻^[1]。大麻可以產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，比如萜烯類、大麻素等，其中包括具有重要醫(yī)用潛力的大麻二酚(Cannabidiol，CBD)^[2]。大麻中的腺毛是一種特殊的表皮毛結(jié)構(gòu)，是大麻次生代謝物產(chǎn)生的重要工廠^[3]。研究發(fā)現(xiàn)通過增加光照或改善營養(yǎng)條件，能增加大麻中這些次級代謝物的含量^[4]。此外，使用包括植物激素在內(nèi)的多種植物生長調(diào)節(jié)劑也可以增加次級代謝物的含量^[5]。

研究表明，R2R3-MYB家族的一些成員可以調(diào)控表皮細胞發(fā)育^[6]。例如，在金魚草中發(fā)現(xiàn)MIXTA基因控制著錐形表皮細胞的分化^[7]。青蒿中的AaMYB1和AaMIXTA1^[8-9]，番茄中的SlMX1^[10]被確定為腺毛啟動的正調(diào)控因子。過表達AaMYB1基因可以增加青蒿植株的腺毛密度^[8-9]，而AaMIXTA1和SlMX1的下調(diào)則會降低腺毛密度^[10]。大麻R2R3-MYB家族基因同樣對腺毛發(fā)育起重要作用^[11]。研究發(fā)現(xiàn)大麻R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMIXTA在雌花中顯著表達。CsMIXTA在煙草中過表達后，煙草葉片的腺毛大小與密度明顯增加，且腺毛分支也顯著增加。這些結(jié)果表明CsMIXTA可能調(diào)控大麻雌性花器官中腺毛的發(fā)生和發(fā)育^[12]。然而，目前該基因的調(diào)控機制與組織表達特性尚不明確。

為了深入探究大麻CsMIXTA基因的功能和調(diào)控機制，本研究克隆了CsMIXTA基因2199bp啟動子序列，并分析了該啟動子序列的順式作用元件。通過5′端啟動子缺失融合GUS基因在煙草和工業(yè)大麻中進行瞬時表達，發(fā)現(xiàn)了該啟動子的核心啟動區(qū)和組織表達特異性，并初步驗證了其順式作用元件的功能。這些結(jié)果為進一步研究CsMIXTA基因的功能和調(diào)控機制提供了參考。

 

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究使用中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所保存的高CBD工業(yè)大麻種質(zhì)‘DMG265’為試驗材料，培養(yǎng)條件為光強471μmolm-2s-1，營養(yǎng)期光周期為18h光照/6h黑暗，花期光周期為12h光照/12h黑暗，濕度50%~60%，溫度(25±2)℃。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所特色蔬菜團隊提供，培養(yǎng)條件為光強471μmolm-2s-1、光周期18h光照/6h黑暗、濕度50%~60%、溫度(25±2)℃。采集成熟期雌花的糖葉，并立即用液氮暫存，隨后放入-80℃冰箱保存，用于提取總DNA。

膠回收試劑盒購自OMEGA公司；高保真酶ApexHFHSDNA聚合酶混合液FS、PCR酶AccurateTaqDNA預混液、DL2199Marker、DL10000Marker購自艾科瑞生物公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ購自NewEnglandBiolabs公司；DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒購自諾唯贊公司；Trelief5αChemicallyCompetentCell感受態(tài)細胞、農(nóng)桿菌GV3101、pClone007購自北京擎科生物科技股份有限公司；GUS染色液、SilwettL-77購自北京酷來搏科技有限公司；RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物公司；MES、MgCl2、葡萄糖、乙酰丁香酮、抗壞血酸購自上海麥克林生化科技股份有限公司；PluronicF-68購自賽默飛世爾科技有限公司；MS培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；由北京擎科生物科技股份有限公司進行引物合成及測序。植物啟動子表達載體pCAMBIA1391、pNC-Green-LUC由本實驗室保存。

1.2CsMIXTA啟動子克隆與分析

按DNA提取試劑盒說明書提取保存工業(yè)大麻‘DMG265’糖葉的總DNA。利用NCBI上的大麻基因組數(shù)據(jù)庫(Cs10:GCA_900626175.2)獲取CsMIXTA基因的基因組信息(LOC115701410)，分析提取其起始ATG上游的啟動子序列，使用Snapgene軟件設(shè)計啟動子克隆引物，命名為MT-F與MT-R(表1)。以總DNA為模板對CsMIXTA基因起始ATG上游2199bp進行克隆。通過膠回收試劑盒回收克隆的片段，并通過pClone007試劑盒進行T載連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細胞中，通過菌落PCR鑒定獲得陽性克隆。陽性克隆菌液質(zhì)粒送北京擎科生物科技股份有限公司測序，并將測序結(jié)果與已知序列在Snapgene軟件上進行比對確認。

1.3CsMIXTA啟動子生物信息學分析

通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測上述克隆獲得的CsMIXTA基因啟動子序列的順式作用元件的功能與位點。通過網(wǎng)站Softberry(http://www.softberry.com)對CsMIXTA啟動子序列進行分析，預測其轉(zhuǎn)錄起始位點。

1.4CsMIXTA啟動子5′端缺失克隆

根據(jù)預測獲得的順式作用元件的功能與位點，以已測序的2199bp啟動子片段為模板進行5′端缺失克隆。以已測序的啟動子全長質(zhì)粒為模板進行PCR擴增(引物序列見表1)，通過膠回收試劑盒回收克隆的片段，并通過pClone007試劑盒進行T載連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進行PCR鑒定，獲得陽性克隆后進行測序確認。

表1本研究所用引物

 

  

1.5CsMIXTA植物啟動子表達載體構(gòu)建

使用植物啟動子表達載體pCAMBIA1391(圖1)對CsMIXTA基因啟動子的表達活性進行分析。依據(jù)載體上的多克隆位點信息，選用BamHⅠ單個限制性內(nèi)切酶，對啟動子全長以及缺失片段設(shè)計同源重組加臂引物(表1)。以啟動子全長以及缺失片段質(zhì)粒為模板進行PCR克隆，純化擴增產(chǎn)物后使用同源重組試劑盒將其與經(jīng)過BamHⅠ單酶切的pCAMBIA1391載體進行同源重組連接。將同源重組液轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進行PCR鑒定，獲得陽性克隆后進行測序確認。

使用熒光素酶表達載體pNC-Green-LUC載體對CsMIXTA基因核心啟動子區(qū)的表達活性進行分析。該載體為NC克隆載體，使用NC克隆通用接頭對CsMIXTA基因核心啟動子片段進行加臂(表1)。以核心啟動子片段為模板進行PCR克隆，純化擴增產(chǎn)物后使用NC克隆試劑盒將其與pNC-Green-LUC載體進行連接。將同源重組液轉(zhuǎn)化到Trelief5α感受態(tài)細胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進行PCR鑒定，獲得陽性克隆后進行測序確認。

  

圖1植物表達載體構(gòu)建示意圖

A：攜帶GUS的pCAMBIA1391；B：攜帶LUC的pNC-Green-LUC；Poly(A)：花椰菜花葉病毒多聚腺苷酸化信號；HygR：潮霉素抗性基因；35SP：花椰菜花葉病毒35S啟動子；NOST：胭脂堿合酶基因終止子；Rluc：海腎熒光素酶；NCFrame：NC克隆框架；GUS：葡糖苷酸酶；LUC：螢火蟲熒光素酶。

1.6農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的植物啟動子表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，平板培養(yǎng)后挑取單菌落并進行PCR鑒定，獲得陽性后將單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600為2，4000×g離心5min集菌，接著加入含有10mmolL−1MES、10mmolL−1MgCl2和200mmolL−1乙酰丁香酮的重懸液(pH5.6)，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌濃度使其OD600為1，并在室溫避光環(huán)境中靜置2~6h。選用移栽后30~40d的本氏煙草，將含有啟動子表達質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射至完全展開的上部2片葉片中，并使用pCAMBIA1391空載體作為為陰性對照。

1.7農(nóng)桿菌介導的工業(yè)大麻瞬時轉(zhuǎn)化

將1.2.5中使用的全長啟動子表達載體質(zhì)粒陽性單菌落農(nóng)桿菌培養(yǎng)物重懸于含10mmolL−1MES、1×MS、2%葡萄糖、0.015%SilwettL-77、0.05%PluronicF-68、5mmolL−1抗壞血酸和200µmolL−1乙酰丁香酮的重懸液中，pH為5.6。將進入花期1周后的工業(yè)大麻植株倒置浸泡在重懸液中，并放入真空室，打開真空泵降低壓力，待壓力值達到80mbar后計算滲透時間。在低壓下5~15min后，緩慢打開釋放閥，使農(nóng)桿菌進入植物組織間隙。

1.8煙草與工業(yè)大麻GUS組織化學染色

在農(nóng)桿菌注射后的煙草葉片中打孔，獲得直徑為5mm的注射煙草葉盤。將葉盤放入GUS染液中，室溫避光條件下靜置過夜。取出染色后的葉片，進行3~4次70%乙醇脫水，直到陰性對照呈白色。最后，在體式顯微鏡下觀察并拍攝樣品。

將侵染后的工業(yè)大麻糖葉摘下，放入GUS染液中，室溫避光條件下靜置過夜。取出染色后的葉片，進行3~4次70%乙醇脫水，直到陰性對照呈白色。最后，在體式顯微鏡下觀察并拍攝樣品。

1.9煙草熒光素染色

在農(nóng)桿菌注射后的煙草葉背上噴施1mmolL−1熒光素酶底物，隨后室溫避光處理7min，放入植物活體成像儀中觀察并拍攝樣品。

1.10不同脅迫環(huán)境下工業(yè)大麻糖葉中CsMIXTA表達分析

分別使用100μmolL-1赤霉素和100μmolL-1脫落酸噴施于開花期的工業(yè)大麻‘DMG265’糖葉。處理24h后，檢測糖葉中的CsMIXTA表達活性。

將工業(yè)大麻‘DMG265’置入4℃植物培養(yǎng)箱中，處理24h后檢測糖葉中的CsMIXTA表達活性。

本研究使用Bio-RadCFX進行qPCR分析。qPCR反應(yīng)內(nèi)參為BUQ5^[13]，CsMIXTA引物見表1。試驗采用4個生物重復。

 

2結(jié)果與分析

2.1CsMIXTA啟動子克隆

以工業(yè)大麻‘DMG265’糖葉的DNA為模板，經(jīng)過PCR克隆獲得2199bp的產(chǎn)物(圖2)，構(gòu)建T載測序比對顯示該片段與基因組Cs10中的CsMIXTA基因的啟動子區(qū)序列一致，成功獲得CsMIXTA基因啟動子片端。

  

圖2CsMIXTA啟動子的克隆

M：DNA分子量標準DL2000；P：全長啟動子。

2.2CsMIXTA啟動子序列分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE對克隆的CsMIXTA基因啟動子序列進行順式作用元件預測發(fā)現(xiàn)，除具有啟動子的基本元件84個TATA-box和15個CAAT-box外，該啟動子序列還具有光響應(yīng)元件(Box4、AE-box、GATA-motif、G-box)、參與光反應(yīng)性的MYB結(jié)合位點(MRE)、晝夜節(jié)律控制元件(circadian)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、赤霉素響應(yīng)元件(TATC-box)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)等(圖3和表2)。

通過網(wǎng)站Softberry中的TTSplantTool在線程序?qū)寺〉腃sMIXTA基因啟動子序列的轉(zhuǎn)錄起始點進行預測，結(jié)果得到5個評分較高的轉(zhuǎn)錄起始點分別位于-92bp、-487bp、-1074bp、-1375bp、-1835bp(表3)。

  

圖3CsMIXTA啟動子序列分析

起始密碼按照ATG的“G”為+1位點，紅色下畫線標注的“G”為轉(zhuǎn)錄起始位點。

表2 CsMIXTA啟動子部分順式作用元件

   

表3 CsMIXTA啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點預測

  

2.3CsMIXTA啟動子缺失片段克隆

根據(jù)PlantCARE預測的順式作用元件將克隆獲得的CsMIXTA基因上游2199bp啟動子片段分為5段啟動子缺失片段。經(jīng)過克隆獲得了長度分別為1756、1413、547、393、99bp的5個5′端缺失啟動子片段，分別命名為P1、P2、P3、P4、P5(圖4)。與全長啟動子序列P相比，P1片段缺失了低溫響應(yīng)元件LTR；P2片段缺失了晝夜節(jié)律控制元件circadian；P3片段缺失了光響應(yīng)元件G-Box和脫落酸響應(yīng)元件ABRE；P4片段缺失了光響應(yīng)元件GATA-motif和G-box；P5片段缺失了赤霉素響應(yīng)元件TATC-box，只含有TATA-box元件(圖5)。

 

  

圖4CsMIXTA啟動子缺失片段克隆

M：DNA分子量標準DL2000；P：全長啟動子；P1~P5：啟動子缺失片段1~5。

  

圖5CsMIXTA啟動子全長及缺失片段示意圖

LTR:低溫響應(yīng)元件;Box4:光響應(yīng)元件;MRE:參與光反應(yīng)性的MYB結(jié)合位點;circadian:晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件;AE-box:光響應(yīng)元件;

ABRE:脫落酸響應(yīng)元件;G-box:光響應(yīng)元件;GATA-motif:光響應(yīng)元件;TATC-box:赤霉素響應(yīng)元件;圖中數(shù)值單位為bp。

2.4CsMIXTA全長及不同缺失啟動子作用下煙草瞬時表達分析

為了驗證CsMIXTA啟動子的核心啟動區(qū)與表達活性，將全長及缺失啟動子片段同源重組到GUS表達質(zhì)粒中，瞬時轉(zhuǎn)化到本氏煙草中，2d后取樣進行GUS染色。由圖6可知，陰性對照(CK)為注射了pCAMBIA1391載體的煙草葉片，呈現(xiàn)無色，證明該載體不具備啟動活性。全長啟動子片段P，缺失片段P1、P2、P3和P4注射的煙草葉片被染成不同成程度的藍色，證明CsMIXTA基因啟動子全長以及前4個缺失序列都具備啟動GUS基因表達的能力。而啟動子缺失片段P5注射的煙草葉片呈現(xiàn)無色，說明該缺失片段不具備啟動GUS基因的能力，由此確定啟動子核心區(qū)域位于P4和P5之間，即-393~-99bp。此外，除P5外的啟動子缺失片段以及全長片段注射的煙草葉片上的大量表皮毛被上了較深的藍色。

  

圖6CsMIXTA啟動子全長及缺失片段作用下的煙草GUS染色

CK：陰性對照；P：全長啟動子；P1~P5：啟動子缺失片段1~5。

2.5CsMIXTA核心啟動子作用下煙草瞬時表達分析

為了驗證CsMIXTA啟動子核心啟動區(qū)的表達活性，將核心啟動區(qū)P4(393bp)片段通過NC克隆到LUC表達質(zhì)粒中，瞬時轉(zhuǎn)化到本氏煙草中，2d后取樣進行熒光素酶檢測。由圖7可知，CsMIXTA的核心啟動子區(qū)具備轉(zhuǎn)錄活性。

 

 

圖7CsMIXTA啟動子核心區(qū)域P4作用下的LUC熒光表達

a~c：P4-LUC注射區(qū)域；d：pNC-Green-LUC空載注射區(qū)域(陰性對照)。

2.6 CsMIXTA全長啟動子作用下工業(yè)大麻糖葉瞬時表達分析

通過農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化方法，CsMIXTA啟動子驅(qū)動GUS基因在工業(yè)大麻糖葉中的表達如圖8所示，在糖葉中的不具備分泌能力的單細胞表皮毛均未被染上色，而大量頭狀無柄腺毛被染成藍色；部分頭狀有柄腺毛的腺毛柄被染成藍色。

  

圖8CsMIXTA全長啟動子作用下的工業(yè)大麻GUS染色

a：單細胞表皮毛；b：頭狀無柄腺毛；c：頭狀有柄腺毛。

2.7不同脅迫處理下工業(yè)大麻糖葉中CsMIXTA表達分析

分析發(fā)現(xiàn)CsMIXTA啟動子區(qū)含有低溫誘導、ABA和GA響應(yīng)元件，本研究利用實時定量PCR檢測4℃、ABA和GA3處理下CsMIXTA在工業(yè)大麻糖葉中的表達量。由圖9可知，4℃處理24h，CsMIXTA的表達量較正常培養(yǎng)條件下表達水平上調(diào)46%；ABA處理下CsMIXTA基因的表達量上調(diào)70%；GA3處理下CsMIXTA基因的表達量上調(diào)65%。說明，低溫、GA3及ABA均能增強啟動子的活性。

  

圖9 3種脅迫處理對CsMIXTA表達模式的影響

*、**、***分別表示在0.05、0.01和0.001水平上差異顯著。

 

3討論

目前工業(yè)大麻腺毛分子機制研究較少，只有3個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被報道。bHLH轉(zhuǎn)錄因子CsMYC4使番茄腺毛密度增加，且其受茉莉酸甲酯正向調(diào)控^[14]。HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子CsHDG5可能正向調(diào)控腺毛發(fā)育^[15]。本研究中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMIXTA在煙草中過表達提高了煙草腺毛密度^[12]，因此CsMIXTA啟動子研究具有重要意義。

啟動子具有多種順式作用元件，對基因的表達調(diào)控具有重要的作用，能夠影響基因的表達水平和空間特異性，有助于研究基因的表達調(diào)控與組織表達特異性^[16-18]。本研究克隆了CsMIXTA基因上游的2199bp啟動子序列，預測分析其順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該啟動子序列除了具有啟動子基本元件TATA-box和CAAT-box外，還存在低溫響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件等順式作用元件，這與擬南芥、玉米等MYB基因家族啟動子順式作用元件的預測結(jié)果相似^[19,20]。我們的研究表明CsMIXTA基因可能受到多個因素的誘導表達。

啟動子的核心區(qū)域在基因表達水平上起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，啟動子缺失法常用于研究啟動子的核心區(qū)域^[21]。為了探索CsMIXTA基因啟動子的核心區(qū)域，本研究將啟動子全長和5個5′端缺失片段融合進了具有GUS基因的植物表達載體并瞬時轉(zhuǎn)化煙草，對各個片段轉(zhuǎn)化的煙草進行GUS染色，發(fā)現(xiàn)只有99bp的缺失片段P5沒有被染色，不具備啟動子活性。因此我們推測CsMIXTA基因啟動子的核心區(qū)域位于P4與P5(-393~-99bp)之間，此外本研究還將P4片段連接了LUC基因在煙草中進行表達，驗證發(fā)現(xiàn)該核心啟動區(qū)具有轉(zhuǎn)錄活性。依據(jù)此核心區(qū)域我們了結(jié)合Softberry預測的轉(zhuǎn)錄起始位點，確定CsMIXTA基因的啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點為鳥嘌呤(G)，位于ATG上游196bp處。除此之外，在除P5外各個片段侵染的煙草葉片的表皮毛都被染上了較深的藍色，表明CsMIXTA啟動子具有組織特異性，可能控制著表皮毛的發(fā)育。

在植物腺毛中發(fā)揮功能的R2R3MYB家族基因，其啟動子大部分能在腺毛中特異表達。青蒿中能夠促進腺毛發(fā)育和青蒿素合成的AaMIXTA1基因的啟動子在腺毛中的表達比在其它區(qū)域強^[9]。棉花中與表皮毛發(fā)育相關(guān)的基因GaMYB2的啟動子在棉花、擬南芥、煙草的腺毛中都具有特異表達^[22]。前人研究發(fā)現(xiàn)CsMIXTA可能調(diào)控大麻雌性花器官中腺毛的發(fā)生和發(fā)育^[12]。為驗證CsMIXTA啟動子在工業(yè)大麻的組織表達模式，本研究將CsMIXTA啟動子全長融合進了具有GUS基因的植物表達載體并侵染工業(yè)大麻糖葉。結(jié)果顯示在工業(yè)大麻糖葉中沒有分泌能力的單細胞表皮毛都沒有被染成藍色，葉表面、頭狀無柄腺毛和部分頭狀有柄腺毛的腺毛柄被染成了藍色，且頭狀無柄腺毛被染得更深。由于在大麻中頭狀有柄腺毛是從頭狀無柄腺毛發(fā)育而來的^[23]，因此CsMIXTA可能在工業(yè)大麻腺毛的生長發(fā)育中起到重要得作用。

在植物表皮毛發(fā)育過程中受到GA等植物激素的調(diào)控。GA主要是通過誘導DELLA降解，協(xié)同促進毛狀體的形成，如擬南芥^[24]、棉花^[25]。而R2R3-MYB中的部分轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控赤霉素的含量，如青蒿中AaMYB1和AtMYB61通過積極影響酶的表達，將GA9轉(zhuǎn)化為生物活性的GA4[9]，菊花中CmMYB2通過與CmBBX24的相互作用改變細胞GA含量^[26]。本研究中使用GA3對工業(yè)大麻進行脅迫處理，CsMIXTA基因顯著上調(diào)，表明該基因?qū)Τ嗝顾啬軌虍a(chǎn)生應(yīng)答，可能間接調(diào)控表皮毛發(fā)育。

研究表明低溫脅迫下番茄SlMYB96表達量升高，揭示了SlMYB96能夠響應(yīng)低溫脅迫，將其沉默后番茄植株抗寒性降低。青海茄參MYB轉(zhuǎn)錄因子McMYB-86在低溫處理的24h內(nèi)顯著上調(diào)表達^[27]。水稻OsMYBR1的啟動子區(qū)域含有ABRE，并且OsMYBR1過表達水稻對ABA的抗性更強，揭示了OsMYBR1過表達水稻通過ABA介導的途徑上調(diào)脅迫響應(yīng)基因增強耐旱性^[28]。本研究4℃、ABA對工業(yè)大麻進行脅迫處理，并進行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示CsMIXTA基因的相對表達量在這2個處理條件下都顯著上調(diào)，表明CsMIXTA基因能對低溫與ABA處理產(chǎn)生應(yīng)答。

 

4結(jié)論

本研究克隆了工業(yè)大麻CsMIXTA基因啟動子，利用生物信息學的方法預測了其可能存在的順式作用元件；通過GUS染色找到了CsMIXTA啟動子的核心區(qū)域位于-393~-99bp；通過啟動子瞬時轉(zhuǎn)化工業(yè)大麻糖葉，發(fā)現(xiàn)該啟動子在腺毛中特異表達；對工業(yè)大麻糖葉進行非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)低溫、GA3及ABA均增強啟動子的活性，這為深入探究CsMIXTA基因的功能及調(diào)控機制提供了理論和試驗依據(jù)。

 

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文章摘自：周智滿,張小雨,高峰,等.工業(yè)大麻腺毛發(fā)育基因CsMIXTA啟動子克隆及功能分析[J/OL].作物學報,1-13[2024-08-19].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20240709.1425.004.html.