摘 要:探究適用于對(duì)苧麻（Boehmeria nivea）進(jìn)行低溫脫膠的酶可以節(jié)約能源，降低對(duì)環(huán)境的影響。本研究從土壤中篩選出果膠酸裂解酶（Pectate lyase，Pel）產(chǎn)生菌，并通過基因克隆表達(dá)獲得該菌的重組Pel，測(cè)定重組Pel的酶學(xué)性質(zhì)后將其應(yīng)用于苧麻的低溫脫膠中。結(jié)果表明，從土壤中獲得一株短小芽孢桿菌Bacillus pumilus B.15-1，該菌株在液體培養(yǎng)時(shí)可產(chǎn)酶0.12U/mL。將其Pel基因克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，用Ni+-親和層析純化獲得分子量為42.56kDa的重組酶。該酶的最適作用pH為8.5，在pH8.5和30℃孵育24h后酶活力無損失；最適作用溫度為55℃，在30℃較穩(wěn)定。rBpumPel-Ec可在30℃對(duì)苧麻進(jìn)行單獨(dú)脫膠，當(dāng)用酶量為25U/mL時(shí)得苧麻失重率為18.65%。rBpumPel-Ec亦能通過與NaOH聯(lián)用的方式提升堿法脫膠的效果，當(dāng)將25U/mL rBpumPel-Ec與0.5%NaOH聯(lián)用時(shí)，苧麻的失重率（30.20%）高于單獨(dú)使用0.5%NaOH時(shí)所得的失重率（23.54%）。本研究結(jié)果表明rBpumPel-Ec在苧麻的低溫脫膠方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
關(guān)鍵詞:果膠酸裂解酶；基因克隆表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)；短小芽孢桿菌；苧麻脫膠；清潔生產(chǎn)
苧麻（Boehmeria nivea）是一種苧麻屬（Boehmeria）的多年生植物，其主要被種植于熱帶、亞熱帶和部分溫帶國家或地區(qū)[1]。中國每年生產(chǎn)50萬噸纖維，該產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的97%，其中苧麻產(chǎn)量最大，又被稱為“中國草”[2]。在所有植物中，苧麻韌皮部所含纖維的長度最長，韌性最高，因此苧麻韌皮纖維被廣泛用于紡織和服裝等行業(yè)中[3]。苧麻韌皮部的成分復(fù)雜，以此制備韌皮纖維的工藝依次為“剝皮”（從植株上分離獲得韌皮部）[4]、“刮麻”（亦稱“刮青”或“刮背”，即把青色的表皮刮掉）[5]和“脫膠”（將果膠、木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分等去除），其中“脫膠”步驟決定了制備所得韌皮纖維的質(zhì)量，因此該步驟對(duì)苧麻的應(yīng)用有重要意義。
傳統(tǒng)脫膠方法為化學(xué)脫膠，即采取化學(xué)物進(jìn)行脫膠，最常用的做法為用NaOH在高于100℃進(jìn)行脫膠[6]，然而所獲效果不夠理想。有研究者嘗試使用其他化學(xué)物，例如Lin等[7]使用共晶溶劑（deep eutectic solvent）進(jìn)行脫膠，發(fā)現(xiàn)在160℃煮沸2.5h能獲得最佳效果；Qu等[8]分別使用甘油、乙二醇、1,2-丙二醇和1,4-丁二醇進(jìn)行脫膠，發(fā)現(xiàn)使用甘油在200℃處理1h能獲得最佳效果，然而由于采用的溫度高，導(dǎo)致能耗高，因此工業(yè)上仍然采用NaOH進(jìn)行脫膠。
生物脫膠包括微生物脫膠和酶法脫膠，其中微生物脫膠是將“刮麻”后的苧麻韌皮部作為微生物生長的基質(zhì)，使用微生物在生長過程中產(chǎn)的果膠酶和半纖維素酶進(jìn)行脫膠。此法可在較低溫度（30-35℃）進(jìn)行微生物的培養(yǎng)和產(chǎn)酶，但此法往往需要較長時(shí)間，致使制作工藝過長[9]。例如Shu等[10]采集107份土壤、田間腐爛苧麻和脫膠池腐爛物等類型樣品，從中篩選獲得一株能高效脫膠的細(xì)菌HG-49，但該菌的脫膠過程需要16h。Yang等[11]從環(huán)境中篩選獲得5株菌株 Dickeya dadantii DCE-01、Bacillus subtilis 1101、Bacillus sp.B6、B. cereus B7和B. cereus B8，將它們兩兩組合進(jìn)行共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn) Dickeya dadantii DCE01+B.cereus B7的共培養(yǎng)組合所獲的粗酶用于脫膠可獲得最佳效果，但脫膠時(shí)間長達(dá)12h。
酶法脫膠是將微生物的生長產(chǎn)酶與脫膠分開，直接使用酶進(jìn)行脫膠，其優(yōu)點(diǎn)是耗時(shí)短于微生物脫膠[12]。酶法脫膠所用的果膠酶以內(nèi)切果膠酸裂解酶（endo-Pectate Lyase，EC:4.2.2.2）最為常見，該酶通過β-消除反應(yīng)隨機(jī)裂解果膠主鏈的α-(1,4)-糖苷鍵，比外切果膠酸裂解酶（exo-Pectate Lyase，EC:4.2.2.9，通過β-消除反應(yīng)裂解果膠主鏈末端的α-(1,4)-糖苷鍵）能更快實(shí)現(xiàn)對(duì)果膠的解聚合[13]。雖然該法用時(shí)比微生物脫膠短，但所用溫度高于微生物脫膠所用溫度，致使能耗稍高。例如Zhao等[14]采用來自 Paenibacillus polymyxaKF-1的酶PpPel10a進(jìn)行脫膠，脫膠時(shí)間為1h，脫膠溫度為50℃；Zhen等[15]采用來自Paenibacillus sp.0602的酶pelNK93I進(jìn)行脫膠，脫膠時(shí)間為1h，脫膠溫度為60℃；Xu等[16]采用來自Dickeya dadantiiDCE-01的酶PelG403進(jìn)行脫膠，脫膠時(shí)間為2h，脫膠溫度為50℃；Xu等[17]采用來自Dickeya dadantiiDCE-01的酶PelG419經(jīng)蛋白質(zhì)工程獲得的突變體進(jìn)行脫膠，脫膠時(shí)間為2h，脫膠溫度為55℃、Liu等[18]采用來自Bacillus sp.B58-2的酶rBvelPL1-Ec進(jìn)行脫膠，脫膠時(shí)間為4h，脫膠溫度為50℃；Zheng等[19]采用來自Bacillus sp.RN1的酶BspPel進(jìn)行脫膠，脫膠時(shí)間為4h，脫膠溫度為50℃。
目前關(guān)于將果膠酸裂解酶用于苧麻的酶法低溫脫膠的研究較少。因此，本研究擬通過基因克隆表達(dá)的方法獲得來自土壤微生物的果膠酸裂解酶，將其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定后應(yīng)用于苧麻韌皮部的低溫脫膠，并評(píng)估該酶單獨(dú)使用及與NaOH聯(lián)用所得效果，以期為該酶的工業(yè)化應(yīng)用研究提供理論指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 樣品處理
將新鮮桔子皮置于50℃的烘箱中干燥至恒重，再使用小型植物組織粉碎機(jī)粉碎，使用60目分樣篩將粉碎物分樣后，所獲粉末用于制作培養(yǎng)基。苧麻韌皮部產(chǎn)自江西宜春市上高縣，將苧麻韌皮部“刮青”后日曬所獲干品再于50℃烘箱中干燥至恒重，備用。
1.1.2 藥品和試劑
聚半乳糖醛酸購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，所有化學(xué)藥品均為分析純。使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司所產(chǎn)的2×Phanta Max Master Mix試劑擴(kuò)增細(xì)菌16SRNA的部分編碼區(qū)序列。
1.1.3 菌株
細(xì)菌B.15-1為本研究從土壤中篩選得到，大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α和Rossetta均存于廣西科學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)研究所微生物與酶工程創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室。
1.1.4 主要儀器與設(shè)備
Infinite 2000酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），OSE-GP-01 PCR儀[天根生化科技（北京）有限公司]，MIN QUAN MQD-B3R恒溫?fù)u床（上海旻泉儀器有限公司），Centrifuge5415D小型常溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司），HICLAVE高壓滅菌鍋（日本Saitama-ken公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），KS-1000ZDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。
1.1.5 培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基的配方為（g/L）：桔子皮粉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0，瓊脂粉20g。篩選培養(yǎng)基為不含瓊脂粉的分離培養(yǎng)基。進(jìn)行種屬鑒定時(shí)所用菌體以不含雜質(zhì)為佳，故所用培養(yǎng)基為不含桔子皮粉的篩選培養(yǎng)基。
1.2 微生物的分離篩選
土壤樣品采自廣西大學(xué)農(nóng)場(chǎng)木薯地。將1g土壤樣品置于裝有10mL無菌水的指形瓶中，在200r/min震蕩10min。將懸濁液用無菌水以10倍為梯度進(jìn)行逐步稀釋，后將稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，置于37℃培養(yǎng)2d。將平板上生長的菌落接種至篩選培養(yǎng)基中（250mL三角瓶裝培養(yǎng)基50mL），置于37℃、200r/min的搖床中培養(yǎng)2d，然后將培養(yǎng)液在10000r/min離心1min，測(cè)定上清液中的果膠酸裂解酶活力。
1.3 種屬鑒定
使用液體培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，將所得培養(yǎng)物在10000r/min離心1min獲得菌體。使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA作為模板，使用通用引物(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R:5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)進(jìn)行16SRNA部分編碼區(qū)序列的擴(kuò)增。所得擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列拼接后進(jìn)行BLASTN（N為nucleotide）搜索。使用MEGA軟件，取芽孢桿菌屬內(nèi)subtilis分枝（Clade）所含物種模式菌株的16SRNA部分編碼區(qū)序列與待鑒定物種的序列進(jìn)行發(fā)育建樹，根據(jù)親緣關(guān)系進(jìn)行物種鑒定。
1.4 酶活力測(cè)定
將40μL適當(dāng)稀釋后的酶液與280μL含0.15%PGA的Tris-HCl緩沖液（0.2M，pH8.5）混合，50℃下孵育10min后加入640μL30mmol/L H3PO4溶液終止反應(yīng),在235nm處測(cè)量不飽和鍵來反映果膠酸裂解酶的活力。一個(gè)單位的酶活力定義為每分鐘產(chǎn)生1µmol不飽和鍵所需的酶量，其中235nm處的分子消光系數(shù)為4600M-1cm-1。將酶液沸水浴5min滅活，其余操作同上作為對(duì)照。
1.5 基因克隆與表達(dá)
在公布于NCBI（National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的短小芽孢桿菌菌株基因組中尋找被預(yù)測(cè)為果膠酸裂解酶（pectate lyase）的假定蛋白質(zhì)（Putative protein），使用SMART在線軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)該假定蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和催化功能域，以決定基因的克隆區(qū)域。從菌株B.15-1的基因組中擴(kuò)增對(duì)應(yīng)基因，將其與載體pET30a(+)進(jìn)行雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pET30a(+)-BpumPel轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rossetta中表達(dá)，誘導(dǎo)條件為20℃、100r/min、1mmol/LIPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）/12h。
使用Clustal X和GENEDOC軟件將克隆所得基因片段編碼的氨基酸序列與芽孢桿菌屬的家族1果膠酸裂解酶進(jìn)行多序列比對(duì)，所用的酶分別為P147（登錄號(hào)BAB40336）[20]、BacPelA（登錄號(hào)KR819891）[21]、Bsp165PelA（登錄號(hào)GU088530，已通過蛋白質(zhì)工程確認(rèn)活性中心內(nèi)催化氨基酸）[22]、PelE（登錄號(hào)AAA24844）[23]、BliPelA（登錄號(hào)KX440958）[24]和BvelPL1（登錄號(hào)OR233722）[18]。
1.6 蛋白質(zhì)純化和功能鑒定
誘導(dǎo)后所得細(xì)胞懸浮于吸附液（NaH2PO4 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，咪唑10 mmol/L，pH 8.0），經(jīng)超聲波破碎后所得總蛋白質(zhì)在10000r/min離心1min，所得上清液為總可溶性蛋白質(zhì)。將上清液用0.45μm的水性濾膜去除雜質(zhì)顆粒后，再與Ni+填料混勻并包裹在冰中，放置于50r/min的往復(fù)式搖床中吸附1h后裝柱。依次使用含有10、35、60、100、200、300、400和500mmol/L咪唑的吸附液潤洗Ni+柱，每個(gè)咪唑梯度均潤洗3倍柱體積，所得洗脫液以SDS-PAGE電泳[25]的方式檢查蛋白質(zhì)純度，并以考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）[26]測(cè)定蛋白質(zhì)的量。
將純化后的重組酶（0.1mg）與含有0.3%聚半乳糖醛酸（PGA）的Tris-HCl緩沖液（1mL，pH8.5）混合，在35℃分別孵育10min和24h，用Aminex HPX 87H柱（Bio Rad，USA）在235nm波長處對(duì)其催化產(chǎn)物進(jìn)行分析，柱溫為50℃，流動(dòng)相為5mmol/L H2SO4，流速為1mL/min，標(biāo)準(zhǔn)品為不飽和半乳糖醛酸（u1）、不飽和雙半乳糖醛酸（uG2）和不飽和三半乳糖醛酸（uG3）。
1.7 酶學(xué)性質(zhì)
1.7.1 最適作用 pH 值
測(cè)定酶在不同pH值中的活力，其中pH4.0-7.0用0.1mol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH7.0-9.0用0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH9.0-11.0用0.1mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液。酶活力最高處為100%，其他酶活力計(jì)為相對(duì)值。
1.7.2 pH 穩(wěn)定性
將酶置于0.1mol/L緩沖液中，在30℃孵育24h后測(cè)定其酶活力。以未孵育的酶液作為標(biāo)準(zhǔn)（酶活力100%），酶液孵育后的活力計(jì)為相對(duì)值。
1.7.3 最適作用溫度
分別測(cè)定酶在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃的活力，其中酶活力最高處為100%，其他酶活力計(jì)為相對(duì)值。
1.7.4 熱穩(wěn)定性
將酶置于30、35、40、45、50、55、60℃孵育15、30、45和60min后測(cè)定其酶活力。以未孵育的酶液作為標(biāo)準(zhǔn)（酶活力100%），酶液孵育后的活力計(jì)為相對(duì)值。
1.7.5 金屬離子
在酶反應(yīng)體系中分別添加0.5、1.0或2.5mmol/L金屬鹽（LiCl、NaCl、MgCl2、KCl、CoCl2、FeCl2和MnCl2）后測(cè)定酶活力，以不額外添加金屬鹽時(shí)測(cè)定所得的酶活力作為標(biāo)準(zhǔn)（酶活力100%），其余酶活力計(jì)為相對(duì)值。
1.8 苧麻脫膠
1.8.1 酶的用量對(duì)脫膠的影響
將1.00g苧麻韌皮部纏繞成直徑為5.0cm的小圈（苧麻圈），按照固液比1:20浸入20mL不同酶濃度（0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 U/mL）的Tris-HCl緩沖液中（pH8.5），在30℃孵育6h后用超純水充分浸洗，瀝干后置于100℃烘干至恒5重。
失重率（%）=（脫膠前的重量-脫膠后的重量）×100/脫膠前的重量[16]。
1.8.2 NaOH 濃度對(duì)脫膠的影響
將苧麻圈浸入20mL不同濃度的NaOH溶液(0.010%、0.020%、0.030%、0.040%、0.05%、0.075%、0.100%、0.250%、0.500%)，在30℃孵育6h（或在105℃的滅菌鍋中孵育2.5h[18]）后用超純水充分浸洗，瀝干后于100℃烘干至恒重，計(jì)算失重率。
1.8.3 酶和 NaOH 聯(lián)合脫膠
先用25U/mL rBpumPel-Ec（單獨(dú)脫膠時(shí)失重率達(dá)到最高值所用的量）對(duì)苧麻圈進(jìn)行脫膠，再將苧麻圈洗滌和烘干后使用0.5%NaOH（單獨(dú)脫膠時(shí)失重率達(dá)到最高值所用的量）在105℃的滅菌鍋中孵育2.5h，計(jì)算苧麻圈的失重率。
1.9 數(shù)據(jù)處理
每個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)由3個(gè)平行數(shù)值得來，使用Excel軟件計(jì)算平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用Excel 2016或Origin 2018軟件作圖，使用SPSS 27.0軟件分析顯著性差異。
2 結(jié)果與分析
2.1 菌株篩選和種屬鑒定
菌株B.15-1在使用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出果膠酸裂解酶活力（0.12U/mL），因此選擇其進(jìn)行進(jìn)一步研究。在枯草桿菌屬subtilis分枝所含物種中，短小芽孢桿菌的16S RNA序列與菌株B.15-1的相應(yīng)序列擁有最近的親緣關(guān)系，因此菌株B.15-1被鑒定為短小芽孢桿菌（圖1）。
圖1 B.15-1 與枯草桿菌屬 subtilis 分枝代表性菌株 16S RNA 部分編碼區(qū)序列的發(fā)育樹
2.2 基因克隆與表達(dá)及蛋白質(zhì)純化
在短小芽孢桿菌3-19的基因組中找到一個(gè)被注釋為假定pectate lyase的蛋白質(zhì)，其登錄號(hào)為QKN79634，將其氨基酸序列提交SMART進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)其第3-32位氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽，因此克隆其第33-347位氨基酸的編碼基因序列。使用上游引物5’-CCCAAGCTTGGGAGGCAAAAGCGGCAG-3’（下劃線處為HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)）和下游引物5’-CCGCTCGAGAGGGTTTACCTTTCCAACACC-3’（下劃線處為XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)）從B.15-1基因組中擴(kuò)增獲得基因BpumPel。通過多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)基因BpumPel編碼的蛋白質(zhì)BpumPel的催化位點(diǎn)為位于保守區(qū)的Arg209和Arg214（圖2）。
圖2 BpumPel-Ec與已報(bào)道的家族1果膠酸裂解酶的多序列比對(duì)
將擴(kuò)增獲得的基因克隆至載體pET30a(+)，獲得質(zhì)粒pET30a(+)-BpumPel。將載體pET30a(+)和質(zhì)粒pET30a(+)-BpumPel分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rossetta并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將細(xì)胞以超聲波破碎后在10000r/min離心1min獲得總可溶性蛋白質(zhì)并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。由圖3可見，相較于含有載體pET30a(+)的細(xì)胞（泳道2），含有質(zhì)粒pET30a(+)-BpumPel的細(xì)胞可額外產(chǎn)生一條約40kDa的條帶（泳道3），經(jīng)過Ni+-親和層析純化后獲得重組蛋白質(zhì)rBpumPel-Ec（泳道4）。酶的回收率達(dá)77.63%，比酶活力為78.26U/mg（表1）。
圖3 B.15-1 重組果膠酸裂解酶 rBpumPel-Ec 的純化
Lane 1: molecular weight ladder; lane 2: total soluble protein of induced E. coli cell harboring pET30a(+); lane 3: total soluble protein of induced E. coli cell harboring pET30a(+)-BpumPel; lane 4: recombinant enzyme rBpumPel-Ec.
表1 B.15-1 重組果膠酸裂解酶 rBpumPel-Ec 的純化
rBpumPel-Ec降解多聚半乳糖醛酸10min后的產(chǎn)物為雙-不飽和半乳糖醛酸（uG2）和三-不飽和半乳糖醛酸（uG3），將降解時(shí)間延長至24h后亦無其他新產(chǎn)物（圖4），因此表明雙-和三-不飽和半乳糖醛酸為降解終產(chǎn)物。
圖4 rBpumPel-Ec 降解產(chǎn)物分析
2.3 rBpumPel-Ec 的酶學(xué)性質(zhì)
rBpumPel-Ec在酸性環(huán)境中酶活力低，其酶活力隨著pH值的升高而升高，至pH值8.5時(shí)達(dá)到最高，因此最適作用pH值為8.5[圖5(a)]。在30℃孵育24h后，置于pH8.5中的rBpumPel-Ec沒有損失酶活力，置于其他pH中后均有不同程度的損失，因此rBpumPel-Ec在pH8.5時(shí)穩(wěn)定[圖5(b)]。在不同溫度下，rBpumPel-Ec的酶活力隨溫度升高而升高，至55℃達(dá)到頂峰，因此其最適作用溫度為55℃[圖5(c)]。rBpumPel-Ec在30℃孵育1h后酶活力剩余88.55%，其穩(wěn)定性隨著溫度升高而變差，其中在60℃孵育1h后酶活力剩余22.05%，延長孵育時(shí)間至1h后酶活力損失殆盡[圖5(d)]。
圖5 pH 值和溫度對(duì) rBpumPel-Ec 酶活力和穩(wěn)定性的影響
(a) Effect of pH on the enzyme activity of rBpumPel-Ec; (b) Effect of pH on the stability of rBpumPel-Ec; (c) Effect of temperature on the enzyme activity of rBpumPel-Ec; (d) Effect of temperature on the stability of rBpumPel-Ec.
0.5mmol/L、1mmol/L和2.5mmol/L的Li+、Na+和K+對(duì)rBpumPel-Ec酶活力的影響范圍均10%（表2）。0.5mmol/L的Mg2+、Fe2+和Co2+對(duì)rBpumPel-Ec酶活力基本無影響，但隨著受測(cè)濃度的升高而表現(xiàn)出抑制作用。
表2 金屬離子對(duì) rBpumPel-Ec 酶活力的影響
Different letters indicate significant differences compared with no addition (P＜0.05)
2.4 rBpumPel-Ec 用于苧麻脫膠
當(dāng)僅以緩沖液浸泡時(shí)（即用酶量為0U/mL），苧麻的失重率為8.60%[圖6（a）]。當(dāng)用酶處理時(shí)，苧麻的失重率隨著用酶量的上升而上升，至15U/mL時(shí)達(dá)到18.44%，繼續(xù)提高用酶量至20U/mL和25U/mL時(shí)，失重率未能繼續(xù)提升。當(dāng)使用0.000%-0.125%NaOH在30℃脫膠6h時(shí)，失重率隨用量的上升而急劇上升，當(dāng)用量達(dá)到0.5%時(shí)達(dá)到頂峰，此時(shí)失重率為21.34%[圖6(b),(圓形圖標(biāo))]；而當(dāng)在105℃脫膠2.5h時(shí)，失重率的增長速度比在30℃脫膠6h時(shí)更快，并且最終獲得的失重率更高（當(dāng)NaOH用量達(dá)到0.5%時(shí)失重率為23.54%）[圖6(b),(菱形圖標(biāo))]。
圖 6 rBpumPel-Ec（a）和 NaOH（b）用于苧麻脫膠
Use of NaOH for ramie degumming was conducted at 30 ℃ for 6 h (empty cycle) and at 105 ℃ for 2.5 h (empty diamond).
如圖7所示，當(dāng)使用0.5%NaOH對(duì)已使用25U/mL rBpumPel-Ec處理后的苧麻韌皮部進(jìn)行脫膠時(shí)（在105℃侵泡2.5h），所得失重率（30.20%）高于25U/mL rBpumPel-Ec（21.34%）和0.5%NaOH單獨(dú)脫膠時(shí)（23.54%），說明rBpumPel-Ec可提升NaOH的脫膠效果。
圖7 rBpumPel-Ec 和 NaOH 單獨(dú)和聯(lián)用于苧麻脫膠的效果比較
Treatment one: control; Treatment two: 25 U/mL rBpumPel-Ec at 30 ℃ for 6 h; Treatment three: 0.5% NaOH at 105 ℃ for 6 h; Treatment four: combination of 25 U/mL rBpumPel-Ec and 0.5% NaOH at 105 ℃ for 6 h.
3 討論
3.1 重組酶的純化和功能鑒定
rBpumPel-Ec的表觀分子量約為40kDa，與其理論分子量42.56kDa一致。當(dāng)使用同樣量的原料和能量時(shí)，表達(dá)宿主能合成更多小分子量的蛋白質(zhì)，因此相比于分子量較大的內(nèi)切果膠酸裂解酶，如來自B. amyloliquefaciens S6的recPELS6（分子量65.75kDa）[27]和來自B.licheniformis的PMGL-Ba（分子量54.6kDa）[28]]，rBpumPel-Ec具備天然優(yōu)勢(shì)。
由于內(nèi)切果膠酸裂解酶的作用模式為隨機(jī)降解果膠內(nèi)部的α-(1,4)-半乳糖醛酸鍵且以uG2和uG3為主要終產(chǎn)物，極少存在uG1和uG4，而rBpumPel-Ec的降解終產(chǎn)物只有uG2和uG3，因此rBpumPel-Ec為內(nèi)切果膠酸裂解酶[29]。與外切果膠酸裂解酶相比，內(nèi)切酶能夠更快促使果膠長鏈的聚合度降低，更加適合被用于脫膠[30]。
3.2 酶學(xué)性質(zhì)
植物組織的自然pH值普遍為弱酸性[31]，因此相比于最適作用pH值更高的內(nèi)切果膠酸裂解酶，如來自 Humicola insolens Y1的PLHY1(pH10.0)[32]、B.clausiiS-4的PNL(pH10.0)[21]、Paenibacillus polymyxa KF-1的PpPel9a(pH10.0)[33]、Bacillus sp.RN1的BspPel(pH10.0)[15]和Bacillus sp.strainP-4-N的Pel-4A(pH11.5)[34]，rBpumPel-Ec更加適合在自然環(huán)境中用于脫膠。rBpumPel-Ec的最適作用溫度低于Bacillus sp.RN1的PelSWU(90℃)[35]、Bacillus sp.RN1的BspPel（80℃）[15]和Bacillus sp.strainP-4-N的Pel-4A（70℃）[34]，但rBpumPel-Ec在30℃表現(xiàn)出更高的相對(duì)酶活力，因而更適合用于低溫脫膠。
金屬離子是植物的必需元素，廣泛存在于植物體內(nèi)的任何組織中。當(dāng)應(yīng)用的對(duì)象為植物組織時(shí)，活力不受金屬離子抑制的酶更具有優(yōu)勢(shì)。苧麻植株地上部分中的金屬離子可達(dá)0.18mmol/kg（以最高者鎘為例）[36]，按本研究脫膠體系換算則體系內(nèi)濃度為0.0088mmol/L。當(dāng)額外添加的金屬離子濃度為0.5mmol/L時(shí)，所有受試金屬離子均不表現(xiàn)出抑制作用，該優(yōu)良特性可確保rBpumPel-Ec在苧麻脫膠體系中正常發(fā)揮作用。
3.3 苧麻脫膠
僅以緩沖液浸泡時(shí)能使苧麻韌皮部失重8.60%，導(dǎo)致該結(jié)果的原因是苧麻韌皮部經(jīng)“刮青”后結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破損，與韌皮纖維結(jié)合松散的物質(zhì)在液體浸泡時(shí)自動(dòng)脫離[37]。Xu等[16]、Liu等[18]和Zheng等[19]亦發(fā)現(xiàn)以緩沖液浸泡時(shí)能使苧麻韌皮部失重，與本研究所得結(jié)果相似。與微生物脫膠法相比，rBpumPel-Ec脫膠所用時(shí)間僅為6h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于Shu等[10]使用細(xì)菌菌株HG-49脫膠所需要的16h、Cheng等[38]使用4個(gè)細(xì)菌菌株脫膠所需要的14.5h、Yang等[11]使用5個(gè)細(xì)菌菌株脫膠所需要的12h和Cheng等[39]使用細(xì)菌菌株B.cereushn1-1脫膠所需要的10h，因此rBpumPel-Ec脫膠比微生物脫膠法更省時(shí)。
雖然酶的應(yīng)用前景與酶學(xué)性質(zhì)有關(guān)，但植物材料成分復(fù)雜，導(dǎo)致酶的脫膠環(huán)境比酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定體系復(fù)雜，因而應(yīng)以脫膠效果作為酶應(yīng)用前景的推斷依據(jù)[37]。rBpumPel-Ec單獨(dú)脫膠所得最高失重率(18.44%)遠(yuǎn)高于Zheng等[19]使用來自Bacillus sp.RN1的BspPel獲得的失重率(9.20%)、Xu等[16]使用來自Dickeya dadantiiDCE-01的Pel419突變酶獲得的失重率(12.89%)、Zou等[40]使用來自B.subtilis7-3-3的B-pN-pelA獲得的失重率(13.50%)和Kapoor等[41]使用來自Bacillus sp.的MG-cp-2所獲得的失重率(13.00%)，表明rBpumPel-Ec單獨(dú)使用時(shí)擁有較高的脫膠效率。
值得注意的是，雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道獲得在聯(lián)用時(shí)能提升NaOH脫膠效果的果膠酸裂解酶，但這些報(bào)道中所得失重率均未高于rBpumPel-Ec與NaOH組合脫膠時(shí)所得數(shù)值，并且rBpumPel-Ec的脫膠溫度(30℃)遠(yuǎn)低于Zhao等[14](來自Paenibacillus polymyxa KF-1的PpPel10a,脫膠溫度50℃)、Xu等[16](來自Dickeya dadantiiDCE-01的Pel403,脫膠溫度50℃)、Liu等[18](來自Bacillus sp.B58-2的rBvelPL1-Ec,脫膠溫度50℃)、Zheng等[19](來自Bacillus sp.RN1的BspPel,脫膠溫度50℃)、Xu等[17](來自Dickeya dadantii DCE-01的PelG419突變酶,脫膠溫度55℃)和Zhen等[15](來自Paenibacillus sp.0602的pelNK93I,脫膠溫度60℃)所用的脫膠溫度，因此相比于上述果膠酸裂解酶，rBpumPel-Ec表現(xiàn)出可以節(jié)省用于維持酶法脫膠條件所用能耗的優(yōu)點(diǎn)。
3.4 該酶的后續(xù)研究方向
結(jié)合已的果膠酸裂解酶的相關(guān)報(bào)道，后續(xù)應(yīng)對(duì)rBpumPel-Ec進(jìn)行以下3方面研究。
(1)蛋白質(zhì)工程。rBpumPel-Ec的比酶活力(78.26U/mg)低于PNL(來自B.clausii,297.10U/mg)[21]?EPLM(來自宏基因組文庫,1524.10U/mg)[42]和rBvelPL1-Ec(來自Bacillus sp.B58-2,1524.10U/mg)[18],并且rBpumPel-Ec在30℃的熱穩(wěn)定性略有不足(雖然rBpumPel-Ec可實(shí)現(xiàn)低溫脫膠,但提高rBpumPel-Ec在30℃的熱穩(wěn)定性則可以節(jié)約用酶成本),可通過蛋白質(zhì)工程的方式解決這些問題?例如Wang等[43]將與PEL168(來自B.subtilis168,比酶活力353.6±25.6U/mg)活性相關(guān)的氨基酸進(jìn)行突變,獲得比酶活力提高至873.3±65.3U/mg的雙突變體K47E/V132F;Xu等[17]將潛在影響PelG403(來自Dickeya Dadantii DCE-01)熱穩(wěn)定性的氨基酸進(jìn)行突變,獲得在50℃t1/2為野生型2.37倍的突變體A129V。
（2）生產(chǎn)成本。本研究使用大腸桿菌生產(chǎn)獲得rBpumPel-Ec，在證實(shí)rBpumPel-Ec具有應(yīng)用潛力后應(yīng)著眼于降低其生產(chǎn)成本。絲狀真菌黑曲霉[44]、米曲霉[45]和草酸青霉[46]等物種可產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶等多種生物質(zhì)水解酶，能通過基因組和轉(zhuǎn)錄組作為宿主表達(dá)外來基因[47]，因此后續(xù)研究可將BpumPel轉(zhuǎn)入絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)以使用廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)持續(xù)高產(chǎn)該酶。
（3）多酶聯(lián)用協(xié)同脫膠。植物細(xì)胞壁最基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)為果膠、木聚糖、甘露聚糖、阿拉13伯聚糖等半纖維素與纖維素構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此在脫膠時(shí)加入其它生物大分子降解酶可提升脫膠效果[48]。例如在微生物脫膠法中，Yang等[11]將高產(chǎn)果膠酸裂解酶的Dickeya dadantii菌株DCE-01與高產(chǎn)木聚糖酶的B.cereus菌株B7進(jìn)行共培養(yǎng)，將苧麻失重率提升至27%。相似地，Edwards等[49]和Duan等[50]在酶法降解細(xì)胞壁生物大分子的研究中亦發(fā)現(xiàn)木聚糖酶和甘露聚糖酶與果膠酶之間存在協(xié)同作用，因此后續(xù)研究可將rBpumPel-Ec與其它生物大分子降解酶配合協(xié)同脫膠。
4 結(jié)論
本研究從土壤中篩選出一株產(chǎn)果膠酸裂解酶的細(xì)菌B.15-1，通過分析其基因組中編碼16SRNA的部分基因序列將其鑒定為短小芽孢桿菌。將其基因組中1個(gè)編碼假定果膠酸裂解酶的基因克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，獲得重組內(nèi)切果膠酸裂解酶rBpumPel-Ec。rBpumPel-Ec的最適作用pH為8.5，最適作用溫度為55℃，且具有優(yōu)良的金屬離子相容性。當(dāng)先用25U/mL rBpumPel-Ec處理苧麻韌皮部再使用0.5%NaOH處理時(shí)，所得失重率(30.20%)高于rBpumPel-Ec(21.34%)和NaOH單獨(dú)脫膠時(shí)(23.54%)，說明rBpumPel-Ec可在低溫下實(shí)現(xiàn)對(duì)苧麻韌皮部的單獨(dú)脫膠，并且能提升NaOH脫膠的效果，因此rBpumPel-Ec在苧麻韌皮部脫膠方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
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文章摘自:周瑨，劉思伽，秦艷，王青艷，冼亮，梁欣泉．短小芽孢桿菌果膠酸裂解酶的功能鑒定及其在苧麻低溫脫膠中的應(yīng)用[J/OL]．廣西科學(xué).https://doi.org/10.13656/j.cnki.gxkx.20250407.001。
