摘 要：該研究以前期篩選分離的7株黑曲霉菌株為研究對象，通過脫膠實驗確定了黑曲霉TJ07為最佳脫膠菌，在此基礎(chǔ)上通過單因素和正交實驗確定了在初始pH為6.0時產(chǎn)苧麻脫膠酶的最佳發(fā)酵條件為：10g/L果膠為碳源，0.8g/L NH4Cl為氮源，在170 r/min下發(fā)酵84 h，在此條件下所產(chǎn)果膠酶酶活為215.64 U/μg、木聚糖酶酶活為73.15U/μg，苧麻失重率達到43.88%。
關(guān)鍵詞：苧麻脫膠；黑曲霉；發(fā)酵；果膠酶；木聚糖酶
苧麻是蕁麻科苧麻屬植物，別名為中國草，是植物來源最好的天然纖維之一，具有誘人的光澤、較強的韌性以及良好的抗菌性［1］，被廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中［2］。苧麻原麻中含有65%～75%的纖維素以及20%～30%的非纖維素物質(zhì)，這部分非纖維素物質(zhì)被稱為膠質(zhì)，不同地域的苧麻中纖維素和膠質(zhì)含量略有差別，苧麻中的膠質(zhì)主要是由15%左右的半纖維素，5%左右的果膠以及1%左右的木質(zhì)素構(gòu)成［3］。苧麻原麻通過脫膠工藝去除膠質(zhì)后才能用于輕工業(yè)生產(chǎn)［4］，而傳統(tǒng)的苧麻脫膠工藝需要在高溫高壓條件下使用大量的堿液以及其他的危險性化學(xué)品，不僅安全性和經(jīng)濟效益欠佳，生產(chǎn)過程中排放的氣體還會對環(huán)境造成嚴(yán)重的危害［5］。
隨著生態(tài)環(huán)境問題被不斷重視，生物脫膠方法因其高效、節(jié)能、降耗、減排等優(yōu)點已成為目前輕工業(yè)的研究熱點以及重要發(fā)展趨勢［6］。苧麻生物脫膠技術(shù)主要包括酶法脫膠和微生物脫膠。酶法脫膠是將高效酶制劑異源表達后對苧麻原麻進行脫膠，但因酶制劑高昂的生產(chǎn)成本，很少有企業(yè)愿意將其應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。自1953年學(xué)界首次證實微生物具備纖維脫膠能力以來，相關(guān)菌種資源研究持續(xù)取得突破，不同研究團隊陸續(xù)報道了多種高效脫膠菌株的篩選與應(yīng)用成果［7-9］，為苧麻脫膠菌種資源的篩選與利用奠定了基礎(chǔ)。微生物脫膠主要是利用微生物的新陳代謝以及產(chǎn)酶機制從而對苧麻膠質(zhì)進行生物轉(zhuǎn)化達到去除膠質(zhì)的目的，而微生物脫膠因其具有節(jié)約成本、能耗低以及對苧麻纖維損害較小的優(yōu)點常常作為生物脫膠中的首選方案［10］。
基于此，本研究團隊前期從麻田表層土、苧麻廠附件原土滲濾液中篩選分離到7株苧麻脫膠菌株，經(jīng)鑒定為黑曲霉。本文以果膠酶酶活、木聚糖酶酶活和苧麻失重率作為評價指標(biāo)［11］，對這7株菌株進行復(fù)篩，并在此基礎(chǔ)上對脫膠條件進行優(yōu)化。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
苧麻：經(jīng)刮青和曬干處理后的苧麻原麻，由達州市全暢麻業(yè)提供；麩皮，市售；D-半乳糖醛酸（分析純）、D-木糖（分析純）、蛋白胨、瓊脂，北京索萊寶科技有限公司；果膠、木聚糖，均為食品級，永順食品配料有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
脫膠菌株（黑曲霉）：TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05、TJ06、TJ07，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心西南站。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：12°Bx米曲汁培養(yǎng)基［12］，121℃滅菌30 min，用于菌株培養(yǎng)。
篩選培養(yǎng)基：0.8g果膠、0.04g NH4Cl、0.2g MgSO4·7H2O、0.1 g K2HPO4、0.001 g FeSO4·7H2O、100mL超純水，pH為6.0，121℃滅菌30 min。
發(fā)酵培養(yǎng)基：8g果膠、0.6g NH4Cl、2g MgSO4·7H2O、1g K2HPO4、0.01g FeSO4·7H2O、1L超純水，pH為6.0，121℃滅菌30 min。
1.2 儀器與設(shè)備
TU-1810紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SPX-250B-2型生化培養(yǎng)箱，上海博迅有限公司；YP402N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CI-2F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；KMCJ-20超純水機，成都浩純儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。
1.3 方法
苧麻脫膠菌種復(fù)篩及最佳發(fā)酵條件研究流程如圖1所示。
圖1 苧麻脫膠菌種復(fù)篩及最佳發(fā)酵條件研究流程
1.3.1 粗酶液酶活檢測及脫膠實驗
將7株脫膠斜面菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度28℃、濕度80%條件下進行繼代培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)至菌落占培養(yǎng)皿80%時，挑取一個接種環(huán)孢子接種于200mL篩選培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵條件為28℃、130r/min，發(fā)酵48h和72h時分別取發(fā)酵液，將發(fā)酵液在4000r/min離心15min后取上清液得到粗酶液，測定粗酶液中苧麻失重率和果膠酶酶活，確定較優(yōu)菌株。
取較優(yōu)菌株，按上述方法再次發(fā)酵48h和72h后制備粗酶液，將苧麻原麻與粗酶液按1∶20（m/m）進行混合，在28℃下脫膠4h后，從粗酶液中過濾出苧麻。用清水將濾出的苧麻進行清洗，隨后在烘箱中烘干至恒重，從而得到脫膠后苧麻質(zhì)量，以苧麻失重率衡量脫膠效果；將經(jīng)過3min煮沸滅活的粗酶液對苧麻原料重復(fù)上述脫膠操作，作為對照組，計算苧麻失重率，判斷粗酶液脫膠效果，得到最優(yōu)脫膠菌株。
1.3.2 最優(yōu)脫膠菌株發(fā)酵培養(yǎng)基碳/氮源選擇實驗
分別選擇果膠、木聚糖、麩皮和果膠＋木聚糖（1∶1，m/m）為備選碳源，添加量均為8 g/L，其他組分同“發(fā)酵培養(yǎng)基”的要求，發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28℃、轉(zhuǎn)速130 r/min、發(fā)酵時間48 h，以果膠酶酶活和木聚糖酶酶活作為評價標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳發(fā)酵碳源。
分別選擇NH4Cl、（NH4）2SO4和蛋白胨為備選氮源，添加量均為0.6 g/L，碳源為“1.3.2”確定的最佳碳源，其他組分同“發(fā)酵培養(yǎng)基”的要求，發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28℃、轉(zhuǎn)速130r/min、發(fā)酵時間48 h，以果膠酶酶活和木聚糖酶酶活作為評價標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳發(fā)酵氮源。
1.3.3 單因素實驗
選擇果膠為碳源，添加量為8 g/L，NH4Cl為氮源，添加量為0.6 g/L，其他組分同“發(fā)酵培養(yǎng)基”的要求，發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28℃、轉(zhuǎn)速130 r/min、發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵初始pH為6.0。以果膠酶酶活和木聚糖酶酶活作為評價標(biāo)準(zhǔn)，分別研究果膠添加量（2、4、6、8、10 g/L）、NH4Cl添加量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、發(fā)酵時間（24、48、72、96、120 h）、轉(zhuǎn)速（110、130、150、170、190 r/min）對脫膠效果的影響。
1.3.4 正交實驗優(yōu)化
以果膠添加量（A）、NH4Cl添加量（B）、發(fā)酵時間（C）、轉(zhuǎn)速（D）為變量，以果膠酶酶活、木聚糖酶酶活和苧麻失重率為評價標(biāo)準(zhǔn)進行四因素三水平的正交實驗，實驗因素水平見表1。
1.4 指標(biāo)檢測
1.4.1 粗酶液果膠酶酶活測定
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱取D-半乳糖醛酸和D-木糖各0.05g，分別用蒸餾水定容至50mL，其濃度均為1.0mg/mL。
表1 正交實驗表
表2 糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按表2配制得到含還原糖0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；D-半乳糖醛酸和D-木糖分別在540nm處進行吸光度測試，取三次檢測平均值，制得二者的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活測定：在50℃、初始pH 7.0條件下，每1mL酶液每1min產(chǎn)生1μg還原糖所需的酶量為一個U（酶活單位）。用DNS法對酶活進行測定。取適合稀釋倍數(shù)的粗酶液0.5mL，加入0.5 g反應(yīng)底物（果膠/木聚糖），搖勻后在50℃水浴中反應(yīng)10min，取出后于沸水浴中加熱至滅活。加入1.5mL DNS試劑迅速在沸水浴中加熱5 min顯色；然后稀釋到10mL，在分光光度計中于540nm處檢測吸光度。用0.5mL滅活發(fā)酵液為對照組。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，帶入待測樣品的吸光度（y）計算出反應(yīng)液中的還原糖含量（x），通過公式（1）換算成對應(yīng)的酶活［13］。
式中：U——脫膠酶活，U/μg；
0.5——取適合稀釋倍數(shù)的粗酶液0.5mL；
10——反應(yīng)時間10 min；
1000——換算系數(shù)；
A——吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的還原糖含量，mg；
N——酶液稀釋倍數(shù)。
1.4.2 苧麻失重率的計算
式中：X——苧麻失重率，%；
M——脫膠前苧麻經(jīng)清洗后烘干至恒重的質(zhì)量，g；
m——脫膠后苧麻經(jīng)清洗后烘干至恒重的質(zhì)量，g。
1.5 數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，采用SPSS 18.0進行正交實驗數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 菌株發(fā)酵產(chǎn)脫膠酶酶活分析
盡可能去除苧麻原麻膠質(zhì)中的果膠和半纖維素是苧麻脫膠工藝的主要目的，因此要求菌株發(fā)酵產(chǎn)的脫膠酶具有高果膠酶酶活和高木聚糖酶酶活。本研究采用DNS法檢測7株脫膠菌株產(chǎn)果膠酶和產(chǎn)木聚糖酶的能力。D-半乳糖醛酸和D-木糖分別在540 nm處進行吸光度測試，得到二者的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線
將7株菌分別發(fā)酵48 h和72 h后的粗酶液進行果膠酶酶活檢測。具體結(jié)果見表3。TJ01、TJ02和TJ07的果膠酶酶活相對較高，發(fā)酵48 h時分別為96.78、66.70、107.26 U/μg，發(fā)酵72 h時分別為94.82、81.19、161.38 U/μg。由圖3可知，粗酶液的脫膠能力與果膠酶酶活呈一定的正相關(guān)趨勢，基于此初步判定TJ01、TJ02和TJ07為較優(yōu)菌株。
2.2 粗酶提取液脫膠實驗結(jié)果
將3株較優(yōu)菌株發(fā)酵48 h和72 h后得到的粗酶液在28℃下進行苧麻脫膠4 h，以相應(yīng)的滅活粗酶液為對照組，實驗結(jié)果見表4。實驗組整體脫膠效果優(yōu)于對照組，說明菌株發(fā)酵粗酶液能夠在脫膠中起到促進作用，其中TJ07失重率最高，脫膠能力最強，綜合菌株酶活測定結(jié)果，優(yōu)選TJ07作為后續(xù)研究菌株。
表3 果膠酶酶活檢測結(jié)果
圖3 各菌株發(fā)酵后的苧麻失重率與果膠酶酶活圖
表4 粗酶液脫膠實驗結(jié)果
2.3 碳/氮源選擇實驗結(jié)果
以TJ07為研究對象，進行碳/氮源選擇實驗，結(jié)果見表5、6。選用果膠作為碳源時，果膠酶酶活最高，達到91.38 U/μg，以麩皮作為碳源時，木聚糖酶酶活最高，達到40.13 U/μg。果膠酶和木聚糖酶均具有脫膠作用，但研究表明果膠酶比木聚糖酶更能去除膠質(zhì)［14］，果膠降解在苧麻脫膠中占據(jù)核心地位，是促進苧麻韌皮膠質(zhì)降解的關(guān)鍵步驟［15］，綜合考慮選用果膠作為碳源。選用NH4Cl作為氮源時，兩種酶活均明顯高于其他實驗組，因此將NH4Cl作為氮源進行后續(xù)研究。
表5 碳源選擇實驗結(jié)果
表6 氮源選擇實驗結(jié)果
2.4 單因素實驗結(jié)果
由表7可知，果膠添加量從2 g/L增加至8 g/L時，果膠酶酶活與木聚糖酶酶活分別從20.05 U/μg和0.00 U/μg提升至91.38 U/μg和38.78 U/μg，表明果膠作為誘導(dǎo)型碳源對黑曲霉TJ07的產(chǎn)酶能力具有明顯促進作用。當(dāng)果膠添加量進一步增加至10 g/L時，兩種酶活分別下降至84.29 U/μg和14.58 U/μg。推測其原因可能是高濃度果膠導(dǎo)致培養(yǎng)基黏度明顯升高，降低了溶氧效率與底物擴散速率，限制菌體對碳源的攝??；也有可能是果膠分子在過飽和狀態(tài)下易發(fā)生膠體凝聚或沉淀，導(dǎo)致部分底物無法被菌株有效利用。此外，碳源過量可能通過碳分解代謝物阻遏效應(yīng)，抑制產(chǎn)酶相關(guān)基因的表達［16］。因此，選擇果膠添加量為8 g/L進行后續(xù)實驗。
表7 果膠添加量實驗結(jié)果
表8 NH4Cl添加量實驗結(jié)果
由表8可知，當(dāng)NH4Cl添加量為0.6 g/L時，果膠酶酶活（123.78 U/μg）和木聚糖酶酶活（27.52 U/μg）均達到最高值。這一現(xiàn)象可能與氮源濃度對菌體代謝的調(diào)控作用密切相關(guān)。氮源是微生物合成胞外酶的關(guān)鍵營養(yǎng)因子，添加適量的NH4Cl可促進黑曲霉TJ07的菌絲生長及產(chǎn)酶相關(guān)基因的表達。但當(dāng)NH4Cl添加量超過0.6 g/L時，酶活明顯下降，推測可能是由于高濃度NH4＋引起的離子抑制效應(yīng)或培養(yǎng)基滲透壓升高，抑制了菌體的生理活性。此外，過量的氮源可能通過碳氮代謝失衡導(dǎo)致微生物優(yōu)先利用氮源進行菌體增殖而非產(chǎn)酶，這與前人研究中黑曲霉產(chǎn)酶受碳氮比調(diào)控的結(jié)論一致［17］。因此，選擇NH4Cl添加量為0.6 g/L進行后續(xù)實驗。
由表9可知，當(dāng)發(fā)酵時間為72 h時，果膠酶酶活（147.53 U/μg）和木聚糖酶酶活（70.93 U/μg）均達到最高值，表明此階段為TJ07菌株的產(chǎn)酶高峰。之后酶活下降，這可能與底物耗盡、產(chǎn)物反饋抑制或酶蛋白的自身降解有關(guān)。此外，長時間發(fā)酵可能引發(fā)菌體自溶，釋放胞內(nèi)蛋白酶破壞酶活性。因此，選擇發(fā)酵時間為72 h進行后續(xù)實驗。由表10可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時，果膠酶酶活（153.43 U/μg）和木聚糖酶酶活（42.36 U/μg）均達到最高值。轉(zhuǎn)速直接影響溶氧水平與混合效率，適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速可增強氣液傳質(zhì)效率，為好氧型黑曲霉提供充足的氧氣，促進其呼吸代謝與產(chǎn)酶過程。然而，轉(zhuǎn)速過高可能導(dǎo)致剪切力增大，破壞菌絲體結(jié)構(gòu)或干擾酶的分泌機制，進而抑制酶活。此外，高轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基泡沫增多可能影響菌體與底物的接觸效率。因此，選擇轉(zhuǎn)速為150 r/min進行后續(xù)實驗。
表9 發(fā)酵時間實驗結(jié)果
由表10可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min 時，果膠酶酶 活（153.43 U/μg）和木聚糖酶酶活（42.36 U/μg）均達 到最高值。轉(zhuǎn)速直接影響溶氧水平與混合效率， 適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速可增強氣液傳質(zhì)效率，為好氧型黑 曲霉提供充足的氧氣，促進其呼吸代謝與產(chǎn)酶過 程。然而，轉(zhuǎn)速過高可能導(dǎo)致剪切力增大，破壞菌 絲體結(jié)構(gòu)或干擾酶的分泌機制，進而抑制酶活。 此外，高轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基泡沫增多可能影響菌體與 底物的接觸效率。因此，選擇轉(zhuǎn)速為 150 r/min 進 行后續(xù)實驗。
表10 轉(zhuǎn)速實驗結(jié)果
2.5 正交實驗結(jié)果
由表11可知，因素A（果膠添加量）與因素C（發(fā)酵時間）的最優(yōu)水平均穩(wěn)定為A（3 10 g/L）和C（3 84 h）。為探究其他因素對果膠酶酶活、木聚糖酶酶活和苧麻失重率的顯著性影響，本研究基于混合效應(yīng)模型，將因素A、C作為隨機效應(yīng)因子（Random Effects），以表征其水平選擇的非系統(tǒng)性變異；同時將因素B（NH4Cl添加量）和因素D（轉(zhuǎn)速）作為固定效應(yīng)因子（Fixed Effects），重點考察其主效應(yīng)，對正交實驗數(shù)據(jù)進行方差分析驗證因素B、D對目標(biāo)指標(biāo)的顯著性貢獻（P＜0.05），正交實驗結(jié)果方差分析見表12。
表11 正交實驗結(jié)果
表12 正交實驗結(jié)果方差分析
采用綜合平衡法確定TJ07脫膠菌株發(fā)酵條件的最優(yōu)方案。由表11可知，以果膠酶酶活為指標(biāo)，因素的主次順序為B＞C＞D＞A，最優(yōu)方案為A3B2C3D2；以木聚糖酶酶活為指標(biāo)，因素的主次順序為D＞A＞B＞C，最優(yōu)方案為A3B1C3D3；以苧麻失重率為指標(biāo)，因素的主次順序為B＞C＞D＞A，最優(yōu)方案為A3B3C3D3。由表12可知，以果膠酶酶活為指標(biāo)，因素B、D影響均不顯著；以木聚糖酶酶活為指標(biāo)，因素D影響顯著，且木聚糖酶酶活和苧麻失重率均在D3更優(yōu)，因此選取D3；以苧麻失重率為指標(biāo)，因素B影響顯著，且苧麻失重率在B3條件下更優(yōu)，因此選取B3。綜上所述，確定最優(yōu)組合為A3B3C3D3，即果膠添加量為10 g/L、NH4Cl添加量為0.8 g/L、發(fā)酵時間84 h、轉(zhuǎn)速170 r/min。將最優(yōu)組合進行3次驗證實驗，得到果膠酶酶活215.64 U/μg、木聚糖酶酶活73.15 U/μg、苧麻失重率為43.88%。
3 結(jié)論
本文以前期從麻田表層土、苧麻廠附近原土滲濾液中篩選分離用于苧麻脫膠的7株黑曲霉為研究對象，對這7株菌的產(chǎn)脫膠酶能力進行研究，根據(jù)脫膠實驗結(jié)果確定黑曲霉TJ07為性能優(yōu)良的脫膠菌，能有效地進行苧麻脫膠。對TJ07產(chǎn)脫膠酶的發(fā)酵條件通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化后，確定TJ07在發(fā)酵初始pH為6.0時的最佳工藝條件為：10 g/L果膠作為碳源、0.8 g/L NH4Cl作為氮源、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時間84 h、轉(zhuǎn)速170 r/min，在此條件下得到的果膠酶酶活為215.64 U/μg、木聚糖酶酶活為73.15 U/μg、苧麻失重率為43.88%。
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文章摘自：廖云生,馮霞,張蓓蓓,等.苧麻脫膠優(yōu)勢菌種篩選及最佳發(fā)酵條件研究[J/OL].食品與發(fā)酵科技,1-8[2025-05-22].http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1713.TS.20250425.1030.002.html.
