摘  要：本發(fā)明提供一種紅麻HcPDS基因VIGS沉默體系，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。通過構(gòu)建含有HcPDS基因特異性片段的pTRV2病毒沉默表達(dá)載體，該載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅麻，誘導(dǎo)紅麻內(nèi)源HcPDS基因發(fā)生沉默，有效降低了紅麻HcPDS基因的表達(dá)水平，導(dǎo)致白化表型。包括如下步驟：構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒pTRV2-HcPDS；制備侵染液；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染紅麻，并后續(xù)檢測基因沉默效率。本發(fā)明的有益效果是首次在紅麻中應(yīng)用VIGS技術(shù)體系，為VIGS技術(shù)體系在紅麻上的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)要點(diǎn)

1.一種紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS，其特征在于：其全長基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種用于沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的HcPDS基因特異性片段，其特征在于：所述HcPDS基因特異性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一種沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的VIGS載體，其特征在于：利用gateway重組克隆技術(shù)將HcPDS基因特異性片段連接至VIGS病毒骨架載體pTRV2中，構(gòu)建獲得重組病毒載體pTRV2-HcPDS。

4.一種紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的VIGS沉默體系，其特征在于，其構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1)通過凍融法將重組病毒載體pTRV2- HcPDS轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性；

(2)將轉(zhuǎn)化后的陽性農(nóng)桿菌菌液與pTRV1菌液按菌液體積比1：1混合制成混合菌液；

(3)通過侵泡法將紅麻種子在步驟(2)的混合菌液中侵泡24h；

(4)檢測：將侵泡后的種子播種后置于培養(yǎng)溫度為22℃，光照/黑暗=14h/10h的條件下生長，觀察新長出的紅麻葉片的表型變化，并檢測葉片中八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的表達(dá)情況，即構(gòu)建得到紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS沉默體系。

5.如權(quán)利要求2所述的HcPDS 基因特異性片段在沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS中的應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求3所述的一種沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶HcPDS基因的VIGS載體在沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS中的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求4所述的一種紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的VIGS沉默體系在沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS中的應(yīng)用。

 

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種紅麻HcPDS基因VIGS沉默體系。

 

背景技術(shù)

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是通過插入目的基因片段的重組病毒來抑制植物內(nèi)源基因表達(dá)的遺傳技術(shù)，主要用于基因的功能分析，是植物體內(nèi)普遍存在的一種遺傳免疫機(jī)制，屬于轉(zhuǎn)錄后沉默。與基因敲除和突變體篩選等轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，VIGS技術(shù)無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，具有周期短、操作簡便和成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域常用的技術(shù)手段之一。廣泛應(yīng)用于植物的生長發(fā)育、抗蟲病和代謝調(diào)控等相關(guān)基因功能研究。到目前為止。TRV-VIGS已在茄屬的番茄、煙草、辣椒、擬南芥、麻風(fēng)樹、矮牽牛、罌粟等植物上成功應(yīng)用。

紅麻(Hibiscus spp.)是繼棉花和黃麻之后的世界上第三大天然纖維作物，廣泛在亞熱帶和熱帶地區(qū)種植，主要分布在中國、印度、泰國、孟加拉國、越南、印度尼西亞、巴西、古巴、伊朗與埃及等。由于紅麻韌皮部纖維具有抑菌、透氣、吸濕性好和可降解等特點(diǎn)，被視為21世紀(jì)潛在的優(yōu)勢作物。

 

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種紅麻HcPDS基因VIGS沉默體系。該體系實(shí)現(xiàn)簡單、快速、高通量分析鑒定紅麻HcPDS基因功能。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS（Phytoene desaturase），其全長基因序列如SEQ ID NO.1所示。

一種用于沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的HcPDS基因特異性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一種沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的VIGS病毒載體，利用gateway重組克隆技術(shù)將HcPDS基因特異性片段連接至VIGS病毒骨架載體pTRV2中，構(gòu)建獲得重組病毒載體pTRV2-HcPDS。

一種紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的VIGS沉默體系，其建立方法包括以下步驟：

(1)通過凍融法將重組病毒載體pTRV2-HcPDS轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性；

(2)將轉(zhuǎn)化后的陽性農(nóng)桿菌菌液與pTRV1菌液按菌液體積比1：1混合制成混合菌液；

(3)通過侵泡法將紅麻種子在步驟（2）的混合菌液中侵泡24h；

(4)將侵泡后的種子播種后置于培養(yǎng)條件為22℃，光照/黑暗=14h/10h的條件下生長，觀察新長出的紅麻葉片的表型變化，并檢測葉片中HcPDS的表達(dá)情況，即構(gòu)建得到紅麻HcPDS基因序列沉默體系。

上述HcPDS基因特異性片段在沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS中的應(yīng)用。

上述一種沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶HcPDS基因的VIGS載體在沉默紅麻HcPDS基因中的應(yīng)用。

上述的一種紅麻HcPDS基因VIGS沉默體系在沉默紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS中的應(yīng)用。

上述紅麻八氫番茄紅素脫氫酶基因（HcPDS，Phytoene desaturase），全長基因序列的獲得：在TAIR網(wǎng)站（https：//www .arabidopsis.org/）獲得擬南芥AtPDS（AT4G14210）基因蛋白質(zhì)序列。然后，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/， Sequence Read Archive(SRA)登錄號PRJNA596386），利用紅麻優(yōu)良品種福紅952的參考基因組（Zhang et al.，2020， Plant Biotechnology Journal，DOI：10.1111/pbi.13341），通過BLASTP查找紅麻同源基因，獲得八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的全長基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述HcPDS基因特異性片段的獲得：以八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的全長基因序列為模板，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HcPDS基因CDS結(jié)構(gòu)域上的250bp特異性片段的引物HcPDS-F和HcPDS-R；其核苷酸序列分別為：

HcPDS-F：SEQ ID NO.2：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGTTAATTTTTTGGAGGCTGCT-3’

HcPDS-R：SEQ ID NO.3：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAGGCCCCGAAGAATATGTGT-3’

取紅麻的幼嫩葉片，用OMEGA試劑盒操作步驟提取RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。以cDNA為模板利用設(shè)計(jì)的特異性引物HcPDS-F和HcPDS-R PCR擴(kuò)增HcPDS 基因特異性片段，其大小為250bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明首次構(gòu)建了紅麻HcPDS基因VIGS沉默體系，獲得了具有能夠使紅麻基因沉默的體系。

(2)本發(fā)明通過，并采用煙草脆裂病毒構(gòu)建紅麻HcPDS基因沉默體系，能夠在紅麻植株內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)擴(kuò)散傳播。

(3)本發(fā)明所述沉默體系能夠有效降低紅麻HcPDS基因的表達(dá)水平，葉綠素被漂白。

 

附圖說明

圖1構(gòu)建重組病毒載體pTRV2-HcPDS農(nóng)桿菌菌液PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNA ladder DL2000；1-6：農(nóng)桿菌克隆。

圖2沉默載體侵染紅麻幼苗后出現(xiàn)的新葉的白化表型形狀。

圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測紅麻HcPDS的沉默效果。CK：空載體pTRV2侵染的紅麻苗；HcPDS：重組病毒載體pTRV2-HcPDS侵染的紅麻苗。

圖4質(zhì)粒pTRV2-HcPDS結(jié)構(gòu)圖。本發(fā)明采用gateway cloning的方法構(gòu)建載體質(zhì)粒pTRV2-HcPDS。其中，ccdB為致死基因，Cm為目標(biāo)基因HcPDS。

 

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

紅麻HcPDS基因特異性的克隆

HcPDS全長基因序列的獲得

首先，在TAIR網(wǎng)站（https：//www .arabidopsis.org/）獲得擬南芥AtPDS（AT4G14210）基因蛋白質(zhì)序列。然后，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，Sequence Read Archive (SRA)登錄號 PRJNA596386），利用紅麻優(yōu)良品種福紅952的參考基因組（Zhang et al.，2020，Plant Biotechnology Journal，DOI：10.1111/pbi.13341），通過BLASTP查找紅麻同源基因，獲得八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS的全長基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

HcPDS基因特異性片段的克隆

以八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS 全長基因序列為模板，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HcPDS基因CDS結(jié)構(gòu)域上的250bp特異性片段的引物HcPDS-F和HcPDS-R；其核苷酸序列分別為：

HcPDS-F：SEQ ID NO.2：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGTTAATTTTTTGGAGGCTGCT-3’

HcPDS-R：SEQ ID NO.3：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAGGCCCCGAAGAATATGTGT-3’

取紅麻的幼嫩葉片，在研缽中用液氮冷凍并研磨成粉狀，然后用OMEGA試劑盒操作步驟提取RNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。取?span lang="EN-US">-80℃凍存的RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。以cDNA為模板利用設(shè)計(jì)的特異性引物HcPDS-F和HcPDS-R PCR擴(kuò)增HcPDS基因特異性片段，其大小為250bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2μL、上下特異性游引物各1.5μL、dNTP(2mM)5μL、10×KOD PCR buffer 5μL、MgSO₄(25mM)2μL、KOD Plus 1μL，補(bǔ)ddH2O至50μL。擴(kuò)增條件為：94℃變性3min、55℃30s、68℃2min 32個循環(huán)、72℃延伸10min。

實(shí)施例2

重組病毒載體pTRV2-HcPDS的構(gòu)建采用Gateway技術(shù)構(gòu)建載體。其操作步驟如下：

將實(shí)施例擴(kuò)增所得的HcPDS基因特異性片段、載體pDONR207和BP酶按體系混勻后，置于25℃的PCR儀中進(jìn)行過夜連接。再將得到的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到DB3.1感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有50μg/mL^-1的慶大霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒pDONR207-HcPDS后，用pDONR207的通用引物pDONR207-F(SEQ ID NO.5)和pDONR207-R(SEQ ID NO.6) PCR擴(kuò)增檢測。再將質(zhì)粒pDONR207-HcPDS、載體pTRV2和LR酶按體系混勻后，置于25℃的PCR儀中進(jìn)行過夜連接。再將得到的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有50μg/mL^-1的卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒pTRV2-HcPDS，用HcPDS-F(SEQ ID NO.2)和HcPDS-R(SEQ ID NO.3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，測序驗(yàn)證序列為HcPDS的特異性片段，即HcPDS基因CDS結(jié)構(gòu)域上的250bp大小的片段(SEQ ID NO.4)。將質(zhì)粒pTRV2-HcPDS（其結(jié)果如圖4所示）通過凍融法轉(zhuǎn)入GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過含有50μg/mL^-1的卡那霉素、50μg/mL^-1的慶大霉素和50μg/mL^-1的利福平的篩選，獲得含目標(biāo)基因片段的農(nóng)桿菌菌株。

實(shí)施例3

紅麻HcPDS基因的功能鑒定

(1)重組病毒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

以pTRV1 質(zhì)粒、pTRV2 質(zhì)粒和pTRV2-HcPDS重組病毒載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取新鮮培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子單菌落（圖1），分別接種到1mLLB液體培養(yǎng)基(Kan，50μg、mL^-1；Gen，50μg/mL^-1；Rif，50μg/mL^-1)中，28℃ 180轉(zhuǎn)min^-1培養(yǎng)24 h；然后轉(zhuǎn)入150mLLB液體培養(yǎng)基(Kan，50μg/mL^–1；Gen，50μg/mL^–1；Rif，50μg/mL^–1)中，28℃ 180轉(zhuǎn)min^-1培養(yǎng)12h；28℃ 5000rpm離心10 min 收集菌體細(xì)胞，以適當(dāng)體積的重懸液(10mmol/L^-1 MgCl₂，10mmol/L^-1MES以及200μmol/L^-1乙酰丁香酮) 重懸至終濃度為OD600=1.5；將重懸液于室溫下靜置3h，將攜帶有pTRV1載體的農(nóng)桿菌GV3101菌液分別與攜帶pTRV2的農(nóng)桿菌GV3101菌液和攜帶pTRV2-HcPDS重組病毒載體的農(nóng)桿菌GV3101菌液的重懸液按體積比1：1混勻制成2種混合菌液，用于侵染紅麻種子。紅麻種子在混合菌液中侵泡24h，將紅麻種子實(shí)驗(yàn)材料置于溫度22℃，光/暗周期14h/10 h的條件下生長。

侵染后紅麻HcPDS基因表達(dá)量測定

播種后3周，觀察新長出的紅麻葉片的表型變化，葉片表型為白色時(shí)（圖2），取其葉片，用RNA試劑盒提取葉片總RNA，以Actin為內(nèi)參基因，通過RT-PCR檢測被沉默后目標(biāo)基因的表達(dá)量。所用引物為：HcPDS-RT-F(SEQ ID NO.7)；HcPDS-RT-R(SEQ ID NO.8)；Actin-RT-F(SEQ ID NO.9)；Actin-RT-R(SEQ ID NO.10)。紅麻葉片中HcPDS基因表達(dá)量測定結(jié)果見圖3，圖3結(jié)果表明：與對照CK相比，受到攜帶pTRV2-HcPDS重組病毒載體農(nóng)桿菌侵染的紅麻葉片中HcPDS基因表達(dá)量顯著降低。

圖1

圖2

 

圖3

圖4

 

摘自國家發(fā)明專利，發(fā)明人：張立武，徐益，張力嵐，祁建民，張列梅，徐建堂，申請?zhí)?span lang="EN-US">202010073462.1，申請日2020.01.22