劍麻(Agave sisalana Perr.)是天門冬科龍舌蘭屬單子葉、單次開花的多年生植物，是熱帶亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟作物，主要被用來提取纖維、皂素和釀酒(Davis et al.，2019)。劍麻可以通過有性和無性方式進行繁殖，其中吸芽和株芽是劍麻無性繁殖的材料?；撀浜?，株芽逐漸在花的脫落口附近開始發(fā)育，直到形成完整的根莖葉結(jié)構(gòu)，從母體脫落后遇土即可生長。單株劍麻可產(chǎn)生500-3000多顆株芽(Szarek and Holmesley，1996)。通過這種方式，劍麻提高了繁殖成功率和子代的成活率，以應(yīng)對極端干旱和高溫環(huán)境。株芽繁殖方式在自然界較少見，對其發(fā)育機制知之甚少。“假胎生”理論認為花發(fā)育被終止后，轉(zhuǎn)而發(fā)育成新的葉或者株芽，發(fā)育過程受到外部環(huán)境和內(nèi)部因子的調(diào)控(Diggle.，1997)。一種假設(shè)認為株芽是由保持分裂能力的無活力細胞在誘導(dǎo)后重啟動發(fā)育而來；另一種假設(shè)認為株芽是在花梗的特定區(qū)域從頭發(fā)育形成(Kerstetter and Hake.,1997；Tooke et al.,2019)。由這兩種假說可以發(fā)現(xiàn)，株芽的發(fā)育與花的發(fā)育、脫落和新的分生組織形成密切相關(guān)。

MADS-box(MCMl、AGAMOUS、DEFICIENS、SRF4) 是調(diào)節(jié)植物花器官形成和脫落的重要調(diào)控基因 (Bey et al.,2004；Rijpkema et al.,2006； Cheng et al.,2021；Noor et al.,2014；Mao et al.,2000)。在劍麻研究中，Zhou(2012)等在Agave hybrid No.11648中發(fā)現(xiàn)了4個Ⅱ型MADS-box基因，其中AhMADS-box1/2/6在花芽發(fā)育初期表達量最高，隨著花的形成其表達量降低。Sandoval(2012)從Agave tequilana(龍舌蘭)中發(fā)現(xiàn)AtqMADS1/2/4/6/7在株芽發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，而AtqMADS3的轉(zhuǎn)錄水平先增加后降低。我們以AhKNOX2(Agave hybrid Knotted1-like homeobox 2)為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)，在Agave hybrid No.11648的cDNA表達文庫中篩選到一個MADS-box基因—AhMADS8937(楊子平等，2020)。AhKNOX2調(diào)控劍麻株芽的發(fā)育(Abraham-Juárez et al.，2010)，而MADS-box能以復(fù)合體的形式調(diào)控其他植物的器官發(fā)育及脫落(Seok et al.,2010 Cseke et al.,2003；Sun et al.,2017；Nakano et al.,2012；Liu et al.,2014)。所以我們認為劍麻AhMADS8937可能通過復(fù)合體的形式調(diào)控劍麻株芽的發(fā)育。為了獲得與AhMADS8937相互作用的蛋白，構(gòu)建AhMADS8937蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究構(gòu)建了AhMADS8937的酵母雙雜交誘餌載體，并檢測其毒性和自激活性。結(jié)果表明誘餌載體對Y2HGold酵母菌無毒性但存在自激活性，5mmol/L的3-氨基-1,2,4-三唑(3-Amino-1,2,4- triazole，3-AT)能抑制自激活性，該結(jié)果為下一步通過酵母雙雜交篩選劍麻中與其互作的蛋白奠定基礎(chǔ)。

1結(jié)果與分析

1.1劍麻AhMADS8937基因誘餌載體的構(gòu)建

以攜帶劍麻AhMADS8937基因的質(zhì)粒為模板，上下游帶EcoR Ⅰ酶切位點的特異引物進行PCR擴增，獲得695bp長的條帶 (圖1A)。利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ對重組載體pGBKT7-AhMADS8937質(zhì)粒單酶切。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)一條7000bp左右的載體條帶和一條750bp左右的目的條帶(圖1B)，說明載體構(gòu)建成功。測序結(jié)果表明插入片段序列沒有發(fā)生突變，可以用于下一步試驗。

圖1 AhMADS8937基因的擴增及pGBKT7-AhMADS8937誘餌載體構(gòu)建

注：A：AhMADS8937基因擴增電泳檢測；B：pGBKT7-AhMADS8937誘餌載體酶切檢測；M1：DL2000 DNA Marker；M2：DL 10000 DNA marker；1：AhMADS8937擴增產(chǎn)物；2：pGBKT7-AhMADS8937質(zhì)粒酶切產(chǎn)物Note：A：Amplification and electrophoresis detection of AhMADS8937 gene；B：Restriction detection of pGBKT7-AhMADS8937 bait vector；M1： DL2000 DNA Marker；M2：DL 10000 DNA marker；1：AhMADS8937 amplification products；2：pGBKT7-AhMADS8937 plasmid enzyme digestion products

1.2誘餌載體毒性檢測

為檢測誘餌載體對Y2HGold酵母菌是否有毒性作用，將分別含誘餌載體pGBKT7-AhMADS8937和空載體pGBKT7的Y2HGold酵母菌株涂布于SD/-Trp(不含色氨酸)固體培養(yǎng)基上。SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，生長的酵母單菌落直徑大于2mm(圖2A)；挑取單克隆接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基后，攜帶誘餌載體的Y2HGold酵母菌與含空載體的酵母菌在SD/-Trp液體培養(yǎng)基中的生長趨勢接近，接種14h之后，培養(yǎng)液的OD600值大于0.8，接種24h之后，培養(yǎng)液的OD600值為1.5(圖2B)。兩個結(jié)果說明pGBKT7-AhMADS8937對酵母Y2HGold菌株沒有毒性作用。

圖2 誘餌pGBKT7-AhMADS8937載體毒性檢測

注：A：含空載體pGBKT7和誘餌載體pGBKT7-AhMADS8937的酵母菌在SD/-Trp培養(yǎng)基的生長狀況；B：含空載體pGBKT7和誘餌載體pGBKT7-AhMADS8937的酵母菌生長曲線Note：A：Growth of yeast containing empty vector pGBKT7 and bait vector pGBKT7-AhMADS8937 in SD/-Trp medium；B：The growth curve of yeast containing vector pGBKT7 and bait vector pGBKT7-AhMADS8937

1.3誘餌載體自激活檢測

誘餌載體自激活試驗結(jié)果顯示(圖3)，含陽性對照載體的酵母在4種培養(yǎng)基上均能生長；陰性對照只在SD/-Trp和SD/-Leu(不含亮氨酸) 兩種培養(yǎng)基生長，含pGBKT7空載體的酵母菌只能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長，在其他4種培養(yǎng)基上無菌落生長；含pGBKT7-AhMADS8937的酵母菌在SD/-Trp和SD/-Trp/-His(不含色氨酸和組氨酸)培養(yǎng)基上生長，在SD/-Leu和 SD/-Trp/-Ade (不含色氨酸和腺嘌呤)上無菌落生長。實驗結(jié)果表明pGBKT7-AhMADS8937對ADE2報告基因沒有激活作用但能激活HIS3報告基因的表達，說明該誘餌載體存在自激活性。

圖3 pGBKT7-AhMADS8937自激活檢測

1.4 3-AT抑制濃度的篩選

由于pGBKT7-AhMADS8937存在自激活，能夠在缺組氨酸的培養(yǎng)基上生長，需要篩選抑制誘餌載體激活的背景生長。我們分析了含0、2.5、5、10mmol/L3-AT的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上酵母菌的生長情況，結(jié)果顯示Y2HGold酵母在含0mmol/L3-AT的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上能生長；在含2.5、5、10mmol/L3-AT及以上濃度的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上不能生長(圖4)。說明5mmol/L的3-AT可以抑制pGBKT7-AhMADS8937的自激活性背景。

圖4不同濃度3-AT下酵母菌生長狀況

2討論

酵母雙雜交是在酵母細胞體內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，能夠以特定蛋白作為誘餌，從指定的cDNA文庫中篩選出與之相互作用的蛋白(Vojtek et al.,1993；Wang et al.，2020)。酵母雙雜交憑借其獨特的優(yōu)勢成為研究蛋白質(zhì)互作的有力工具。首先，蛋白質(zhì)互作發(fā)生在酵母細胞內(nèi)，保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不被破壞；其次，酵母雙雜交系統(tǒng)敏感度高，能檢測到較弱的蛋白質(zhì)互作；另外，可以直接獲得互作蛋白的核酸序列，省略了蛋白質(zhì)提取純化等繁瑣步驟。然而，由于典型的轉(zhuǎn)錄因子具備DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域(Keegan et al.,1986； Ma and Ptashne.,1987)，在利用酵母雙雜交篩選互作蛋白之前，必須檢測其自激活性并篩選抑制自激活的最佳抑制劑濃度，以減少酵母雙雜交中的假陽性。3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-AT)是組氨酸合成酶的競爭性抑制劑，能夠抑制組氨酸的合成 (Durfee et al.，1993)。本實驗中pGBKT7-AhMADS8937可以在缺乏色氨酸(SD/-Trp) 和雙缺色氨酸、組氨酸 (SD/-Trp/-His) 的培養(yǎng)基上生長，說明該基因可激活HIS3報告基因的表達，存在自激活性。經(jīng)篩選，SD/-Trp/-His培養(yǎng)基中添加5mmol/L 3-AT能抑制pGBKT7-AhMADS8937的自激活。

Sandoval等(2012)發(fā)現(xiàn)MADS-box調(diào)控劍麻的開花以及花器官的發(fā)育，同時發(fā)現(xiàn)MADS-box在株芽發(fā)育的不同階段表達量發(fā)生改變，暗示MADS-box可能參與劍麻株芽的發(fā)育。Abraham-Juárez等(2010)發(fā)現(xiàn)龍舌蘭中AtqKNOX1/2的表達量隨著株芽的發(fā)育逐漸升高，原位雜交結(jié)果表明AtqKNOX2在株芽形成的早期和后期均發(fā)揮作用，而AtqKNOX1僅在株芽形成后期發(fā)揮作用(Abraham-Juárez et al.,2010)，表明KNOX調(diào)控了株芽的發(fā)育。我們以AhKNOX2為誘餌載體篩選獲得一個MADS-box蛋白，這一結(jié)果不僅暗示MADS-box參與了劍麻的株芽發(fā)育，同時表明MADS-box可能以復(fù)合體的形式參與株芽發(fā)育的調(diào)控。在其他植物中，MADS-box通過復(fù)合體的形式調(diào)控了多個發(fā)育事件。例如，水稻OsMADS1與OsMADS4形成二聚體后，可進一步與OsMADS6、OsMADS7、OsMADS8等蛋白形成多聚復(fù)合物調(diào)控花柱發(fā)育(Seok et al.，2010)；楊樹MADS-box蛋白PTM5與肌動蛋白解聚因子(PtADF) 和富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白(PtLRR)互作，調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育(Cseke et al.,2003)。Nakano報道番茄中兩個調(diào)控離區(qū)發(fā)育的MADS-box蛋白MACROCALYX(MC)和JOINTLESS蛋白之間存在相互作用(Nakano et al.，2012)。Liu報道MC、JOINTLESS和SEPALLATA(SEP)3個MADS-box蛋白形成三元復(fù)合體，調(diào)控番茄離區(qū)的發(fā)育(Liu et al.,2014)。我們的研究表明AhMADS8937與AhKNOX2存在直接相互作用關(guān)系，但是AhMADS8937與AhKNOX2相互作用調(diào)控株芽發(fā)育的機制尚不明確。同時，有必要篩選其他與AhMADS8937相互作用的蛋白，以完善AhMADS8937調(diào)控株芽發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)。

3方法與材料

3.1材料

攜帶AhMADS8937基因的pGADT7質(zhì)粒為本實驗室保存。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自北京中科瑞泰生物公司。限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hi-Fushion連接酶、KOD高保真酶購自江蘇愚公生物技術(shù)公司。擴增引物由廣東省艾基生物公司合成。

3.2劍麻AhMADS8937基因的擴增

設(shè)計上下游帶EcoR Ⅰ酶切位點的引物(表1)，以攜帶AhMADS8937基因的質(zhì)粒為模板、使用KOD高保真酶進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：2×KOD EZ Buffer 25μL，10mmol/L的dNTPs 1μL，cDNA模板2μL，pGBKT7-AhMADS8937-F和pGBKT7-AhMADS8937-R引物各1μL，用NF Water補齊至50μL。PCR程序擴增為：94℃ 2min；98℃ 30s，58℃ 30s，68℃ 1min，35循環(huán)；68℃ 5min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 AhMADS8937擴增引物

3.3pGBKT7-AhMADS8937誘餌載體的構(gòu)建

利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，對擴增獲得的劍麻AhMADS8937片段進行純化。pGBKT7載體質(zhì)粒用EcoR Ⅰ單酶切，切膠回收線性化載體。將目的條帶和線性化載體用Hi-Fushion連接酶連接，50℃，30min；采用熱激法將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，轉(zhuǎn)化液涂于含Kan抗生素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12h。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定。將陽性克隆擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進行PCR擴增和酶切驗證，驗證正確的質(zhì)粒由廣東艾基生物科技有限公司進行測序。酶切驗證和測序正確的質(zhì)粒用于下一步實驗。

3.4酵母Y2HGold感受態(tài)的制備及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

進行酵母感受態(tài)制備時，將保存的Y2HGold甘油菌解凍后劃線于YPDA固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)4d。將活化的Y2HGold酵母菌接種于5mL YPDA培養(yǎng)基中，28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1mL菌液接種至100mL YPDA培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.60。將菌液分裝至2個滅菌50mL離心管中，9000r/min離心5min收集菌體。棄上清，菌體沉淀用30mL滅菌水重懸，9000r/min離心5min，棄上清。菌體沉淀用1.5mL 1.1×TE/LiAC重懸，12000r/min離心15 s后棄上清。菌體用600μL 1.1×TE/LiAC懸浮，置于冰上待用。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)時，10μL carrier DNA于96℃變性5min，冰浴2min。將10μL變性的 carrier DNA與待轉(zhuǎn)化質(zhì)?；靹?，加入50μL新鮮制備的Y2HGold酵母感受態(tài)和500μL PEG/LiAC混合后混勻，30℃孵育30min，每10min上下顛倒混勻。加入20μL DMSO吸打混勻，42℃孵育15min，顛倒混勻。12000r/min離心15s后棄掉上清液，加1mL YPDA培養(yǎng)基，28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)90min。12000r/min離心15s收集菌體，棄掉上清液加1mL生理鹽水，吸取100μL菌體涂布于SD/-Trp平板，30℃靜置培養(yǎng)3d。

3.5 pGBKT7-AhMADS8937誘餌載體毒性及自激活檢測

將pGBKT7-AhMADS8937和pGBKT7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2Hgold酵母菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上，從SD/-Trp培養(yǎng)基上挑取單克隆接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)。測定培養(yǎng)后的第6、12、18、24h的OD600的吸光值，分析pGBKT7-AhMADS8937誘餌載體對Y2HGold酵母菌是否有毒性。

將pGBKT7-AhMADS8937和pGBKT7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂布在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4d，觀察各培養(yǎng)基上菌落生長狀況，分析pGBKT7-AhMADS8937誘餌載體是否具有自激活性。

3.6 3-AT抑制濃度的篩選

將含重組質(zhì)粒的pGBKT7-AhMADS8937的Y2HGold酵母菌涂布于含0、2.5、5、10mmol/L 3-AT (3-氨基1,2,4-三唑) 的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)8d，觀察不同抑制濃度下酵母菌的生長情況，分析最佳3-AT抑制濃度。

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文章摘自：楊茜,徐蕾,汪詢,楊子平,周文釗.劍麻AhMADS8937基因酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建、毒性和自激活檢測[J/OL].分子植物育種：1-11[2021-12-22].