摘 要：本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因及其應(yīng)用，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示，本發(fā)明提供了工業(yè)大麻雙分體病毒基因序列，利用本發(fā)明提供的序列，采用現(xiàn)有技術(shù)手段，制備的用于檢測(cè)該病毒的引物、試劑盒或者抗體蛋白等可以用于培育脫毒工業(yè)大麻種苗，優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻種子檢測(cè)，工業(yè)大麻病害檢測(cè)等多個(gè)場(chǎng)景中，對(duì)該病害進(jìn)行快速診斷和及時(shí)防控。
權(quán)利要求書(shū)
1.一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一種檢測(cè)雙分體病毒基因的產(chǎn)品，其特征在于，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品為特異性引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，檢測(cè)dsRNA1的特異性引物序列如SEQ ID NO:3、4、9或11所示；檢測(cè)dsRNA2的特異性引物序列如SEQ ID NO:5、6、7、8、10、或12所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品為試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒含如SEQ ID NO:3～12所示任一條引物序列。
7.權(quán)利要求2 6任一所述產(chǎn)品在培育脫毒工業(yè)大麻種苗、優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻種子檢測(cè)或工業(yè)大麻病害檢測(cè)中的應(yīng)用。
8.雙分體病毒基因在制備檢測(cè)工業(yè)大麻雙分體病毒的引物、探針或試劑盒，或用于表達(dá)載體構(gòu)建，基因編輯，或用于制備抗工業(yè)大麻雙分體病毒抗體中的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
9.一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）提取待測(cè)樣品總RNA；
（2）使用逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；繼續(xù)以cDNA為模板，在DNA多聚酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆、測(cè)序，得到特異片段；
（3）通過(guò)電泳分析PCR產(chǎn)物或者在PCR過(guò)程中加入熒光探針或染料，通過(guò)分析熒光信號(hào)的變化來(lái)確定樣品中病毒RNA的存在和相對(duì)量；所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。
10.一種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子為病毒基因逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
工業(yè)大麻（Industrial Hemp）是指大麻植株干物質(zhì)中四氫大麻酚（THC）含量低于0.3％的大麻品種類(lèi)型。工業(yè)大麻全身都是“寶”，莖可以制成植物纖維，花葉提取CBD，籽可以提煉食用油、蛋白粉，可以制成中藥材用在化妝品中，工業(yè)大麻在多個(gè)領(lǐng)域的廣泛的應(yīng)用正逐步被人們認(rèn)識(shí)、開(kāi)發(fā)及利用。云南是我國(guó)允許工業(yè)大麻種植的兩個(gè)省份之一，在公安的監(jiān)管下可合法推廣利用，工業(yè)大麻種植遍及13個(gè)州的38個(gè)縣，種植中發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻出現(xiàn)花葉黃化，葉片褪綠、明脈小葉、葉片矮縮、植株死亡等癥狀，給工業(yè)大麻的質(zhì)量和產(chǎn)量帶來(lái)了一定的損失，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致病害發(fā)生的是一種雙分體病毒。
雙分體病毒（Partitiviridae）是一類(lèi)具有雙鏈RNA（dsRNA）基因組的病毒，基因組片段長(zhǎng)度約為1.3 2.5 kb，兩條dsRNA每條都有且只有1個(gè)開(kāi)放閱讀框，dsRNA1負(fù)責(zé)編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RdRp），而dsRNA2主要負(fù)責(zé)編碼衣殼蛋白（cp）。雙分體病毒已被證明感染廣泛的宿主，包括植物、真菌和原生動(dòng)物，被侵染的植物、作物產(chǎn)量、品質(zhì)會(huì)下降，雙分體病毒通過(guò)垂直傳播將病毒從母體遺傳到子代，在無(wú)性繁殖和有性繁殖中均存在。在無(wú)性繁殖中，母體的根、莖、葉、愈傷組織等均含有病毒，采用根、莖、葉、愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)后，新生一代植株會(huì)攜帶病毒。大多數(shù)的高等植物均為有性繁殖，在此過(guò)程中如母體帶有病毒，病毒則會(huì)跟隨種子進(jìn)行傳播。病毒的防治及其困難，至今尚無(wú)完全有效的方法，因此，分離、鑒定工業(yè)大麻雙分體病毒及其基因組是對(duì)該病害進(jìn)行快速診斷，加強(qiáng)病毒的早期檢測(cè)，是培育無(wú)毒工業(yè)大麻種苗，預(yù)防與控制工業(yè)大麻病毒病的重要手段。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因，以及提供該工業(yè)大麻雙分體病毒基因的應(yīng)用，具體的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
一方面本發(fā)明提供一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)雙分體病毒基因的產(chǎn)品，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
進(jìn)一步的，所述產(chǎn)品為特異性引物。應(yīng)當(dāng)能理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本發(fā)明提供的病毒基因序列，根據(jù)相應(yīng)的檢測(cè)方法，利用使用在線工具如Primer3、SnapGene、Benchling等進(jìn)行符合檢測(cè)原理的引物設(shè)計(jì)。
本發(fā)明的基因組全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂?/font>PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的產(chǎn)品中，檢測(cè)dsRNA1的特異性引物序列如SEQ ID NO:3、4、9或11所示；檢測(cè)dsRNA2的特異性引物序列如SEQ ID NO:5、6、7、8、10、或12所示。
進(jìn)一步的，所述產(chǎn)品為試劑盒。所述試劑盒含如SEQ ID NO:3～12所示任一條引物序列，在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒為RT反應(yīng)試劑盒，包括引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RT反應(yīng)緩沖液和底物等試劑，在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒為PCR反應(yīng)試劑盒，包括引物、Tag DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液和底物等試劑。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供所述產(chǎn)品在培育脫毒工業(yè)大麻種苗、優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻種子檢測(cè)或工業(yè)大麻病害檢測(cè)中的應(yīng)用。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供雙分體病毒基因在制備檢測(cè)工業(yè)大麻雙分體病毒的引物、探針或試劑盒，或用于表達(dá)載體構(gòu)建，基因編輯，或用于制備抗工業(yè)大麻雙分體病毒抗體中的應(yīng)用，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。在一些具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的提供的工業(yè)大麻雙分體病毒基因即病毒抗原或其抗原性片段，可用于免疫試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗體水平(或相反，可用抗病毒抗體來(lái)檢測(cè)抗原水平)。根據(jù)明確的免疫試驗(yàn)，可以開(kāi)發(fā)重組抗原，以代替侵入性診斷方法。可檢測(cè)工業(yè)大麻樣品中病毒蛋白或其片段的抗體。免疫試驗(yàn)的設(shè)計(jì)可作很大變化，其各種方案均是本領(lǐng)域中已知的。免疫試驗(yàn)的方案可基于例如競(jìng)爭(zhēng)性、或直接反應(yīng)或夾心型試驗(yàn)。方案例如還可采用固體支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多數(shù)試驗(yàn)涉及采用標(biāo)記的抗體或多肽；該標(biāo)記例如可以是熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射活性標(biāo)記或染料分子。擴(kuò)增探針信號(hào)的試驗(yàn)也是已知的；其例子是采用生物素和親和素的試驗(yàn)，酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫試驗(yàn)，如ELISA試驗(yàn)。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
（1）提取待測(cè)樣品總RNA；
（2）使用逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；繼續(xù)以cDNA為模板，在DNA多聚酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆、測(cè)序，得到特異片段；
（3）通過(guò)電泳分析PCR產(chǎn)物，觀察是否有與預(yù)期大小相符的條帶出現(xiàn)，以此判斷樣品中是否含有目標(biāo)病毒RNA；或者使用qRT PCR，即在PCR過(guò)程中加入熒光探針或染料，通過(guò)分析熒光信號(hào)的變化來(lái)確定樣品中病毒RNA的存在和相對(duì)量。
所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，所述核酸分子為病毒基因逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。
本發(fā)明達(dá)到的技術(shù)效果：工業(yè)大麻病毒在工業(yè)大麻上引起工業(yè)大麻花葉黃化，葉片褪綠、葉片矮縮、花葉發(fā)育不良致使大麻死亡等癥狀，給工業(yè)大麻種植企業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，本發(fā)明通過(guò)病害植株宏觀基因組測(cè)序，并將基因組序列比較分析，鑒定并分離獲得了引起工業(yè)大麻病害的工業(yè)大麻雙分體病毒，該病毒是發(fā)明人首次從病害工業(yè)大麻分離獲得的病毒，該病毒的基因組序列信息及功能基因國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。該病毒基因組序列的獲得對(duì)了解病毒來(lái)源、進(jìn)化過(guò)程及分子流行病學(xué)有重要意義，同時(shí)也為該病害鑒別診斷以及抗病基因的研制奠定了基礎(chǔ)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
本發(fā)明提供了工業(yè)大麻雙分體病毒基因序列，利用本發(fā)明提供的序列，采用現(xiàn)有技術(shù)手段，制備用于檢測(cè)該病毒的引物、試劑盒或者抗體蛋白等，可以用于培育脫毒工業(yè)大麻種苗，優(yōu)質(zhì)大麻種子檢測(cè)，大麻病害檢測(cè)等多個(gè)場(chǎng)景中，對(duì)該病害進(jìn)行快速診斷和及時(shí)防控。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明從種植大田采集的感染雙分體病毒的工業(yè)大麻植株性狀圖；
圖1
圖2為本發(fā)明于實(shí)驗(yàn)室接種雙分體病毒后的工業(yè)大麻植株性狀圖。
圖2
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所提供的工業(yè)大麻雙分體病毒基因序列為兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)高通量測(cè)序分析結(jié)果獲得與各病毒有關(guān)的contigs序列，通過(guò)NCBI對(duì)這些contigs進(jìn)行BLAST比對(duì)，從結(jié)果中選擇序列一致性最高的同源病毒作為參考序列，使用軟件Premier 5并基于病毒contigs基因組序列針對(duì)性地設(shè)計(jì)幾對(duì)特異性引物擴(kuò)增大麻雙分體病毒并驗(yàn)證從頭組裝的病毒序列的正確性（表1）。根據(jù)本發(fā)明病毒基因序列和引物，可選擇性的采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT PCR）、多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT qPCR）等技術(shù)對(duì)待測(cè)工業(yè)大麻樣品進(jìn)行檢測(cè)。
以下以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明：
實(shí)施例1
大麻雙分體病毒檢測(cè)和驗(yàn)證
1.材料
于云南省小哨基地采集2份大麻樣品，一份表現(xiàn)為葉片褪綠、明脈小葉、矮縮；另一份表現(xiàn)為花葉黃化、褪綠（圖1）。
2.RT PCR、RACE和測(cè)序
2.1 RT PCR
（1）工業(yè)大麻樣品總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
采用Eastep®Super總RNA提取試劑盒（Promega，上海）提取大麻樣品總RNA,采用Hifair®III Ist Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(翌圣,上海,中國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)cDNA。
（2）PCR反應(yīng)
PCR反應(yīng)體系(50uL):
2×Hiffer®Robust PCR master Mix(翌圣,上海,中國(guó))25uL，
VCV RNA1F/VCV RNA2 1F/VCV RNA2 2F分別各(10 pmol/L)1uL，
VCV RNA1R/VCV RNA2 1R/VCV RNA2 2R分別各(10 mol/L)1 uL，
cDNA模板5 uL,
ddH2 0 18 uL。
擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性10s,56℃退火20s,72℃延伸30s,33個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行純化回收，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)序。測(cè)序返回序列利用DNAMAN 5.0進(jìn)行序列處理、分析和序列拼接，從而得到2條大麻雙分體病毒dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。
2.2 RACE驗(yàn)證
按照制造商的說(shuō)明，使用SMARTerRACE5′/3′試劑盒（艾科瑞，中國(guó)湖南）根據(jù)設(shè)計(jì)的5′RACE特異性引物（SEQ ID NO:11或12）和3′RACE特異性引物（SEQ ID NO:9或10），具體序列參見(jiàn)表1，擴(kuò)增大麻雙分病毒的5'和3'末端序列。
首先使用艾科瑞生物工程（湖南）股份有限公司的試劑盒Evo M MLV RTase for RACE進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。將總RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，3′RACE cDNA 20uL的反應(yīng)體系包括2uL總RNA、1uL 3’RACE RT Primer、8.5uL Nuclease free water;5′RACE cDNA 20uL的反應(yīng)體系包括2uL總RNA、1uL 5’RACE RT Primer、7.5uL Nuclease free water,隨后72℃保溫3min，冰上靜置兩分鐘。分別在11.5uL 3′RACE cDNA和10.5uL 5′RACE cDNA體系中分別加入4uL 5X RACE RT Buffer、2uL dNTP Mix、0.5uL RNase Inhibitor、2uL Evo M MLV RTase for RACE，在5′RACE cDNA額外加入1uL Template Switching Oligo，構(gòu)成20ul體系，并于42℃保溫90min、72℃保溫15min。
隨后使用cDNA與大麻雙病毒設(shè)計(jì)5′和3′特異性引物進(jìn)行PCR，50uL反應(yīng)中包含3uL cDNA、1uL Universal Short Primer、1uL 5′特異引物（SEQ ID NO:11或12）和3′特異引物（SEQ ID NO:9或10）、20uL 5X L Exp Taq PCR Buffer、0.5uL L Exp Taq HS DNA Polymerase、2uL dNTP Mix、20.5uL ddH20。
擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性1 min;94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸3min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行純化回收，并連接到pMD18 T克隆載體(TaKaRa)上，之后熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a(TaKaRa)中。在含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選后，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)序。利用DNAMAN 5.0進(jìn)行序列處理、分析,獲得完整得5'和3'序列。通過(guò)序列比對(duì)和分析，結(jié)果表明本發(fā)明提供的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列是正確的。
表1 RT PCR擴(kuò)增大麻雙分體病毒引物
實(shí)施例2
工業(yè)大麻雙分體病毒檢測(cè)方法
一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
（1）提取待測(cè)樣品總RNA：采用Eastep®Super總RNA提取試劑盒（Promega，上海）提取大麻樣品總RNA,
（2）使用逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Hifair®III Ist Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(翌圣,上海,中國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)cDNA；繼續(xù)以cDNA為模板，在DNA多聚酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆、測(cè)序，得到特異片段；PCR反應(yīng)體系(50uL):
2×Hiffer®Robust PCR master Mix(翌圣,上海,中國(guó))25uL，
VCV RNA1F/VCV RNA2 2F分別各(10pmol/L)1uL，
VCV RNA1R/VCV RNA2 2R分別各(10mol/L)1 uL，
cDNA模板5uL,
ddH20 18uL。
擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性10s,56℃退火20s,72℃延伸30s,33個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。
（3）通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，觀察是否有與預(yù)期大小相符的條帶出現(xiàn)，以此判斷樣品中是否含有目標(biāo)病毒RNA。
采用上述方法，通過(guò)對(duì)20個(gè)接種病毒的工業(yè)大麻（圖2）樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期一致，說(shuō)明建立的RT PCR檢測(cè)技術(shù)體系可以用于工業(yè)大麻田間樣品的病毒檢測(cè)。
以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，然其并非用以限制本發(fā)明。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型。因此凡采取等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
文章摘自國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因及其應(yīng)用，發(fā)明人：許艷萍，鄭寬瑜，陳璇，楊明，蘇曉霞，呂品，賈永，張園，字雪靖，張慶瀅，郭蓉，楊若菡，申請(qǐng)?zhí)?/font>：202510445885.4，申請(qǐng)日：2025.04.10
