摘  要: 以羅布麻葉為原料，接種黑曲霉進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵后的樣品進(jìn)行凍干處理，測(cè)定其氨基酸、蛋白質(zhì)和還原糖含量，分析主要酚類物質(zhì)的變化及抗氧化活性。結(jié)果表明，發(fā)酵的前6天氨基酸及蛋白質(zhì)含量無顯著變化，但到12天時(shí)粗蛋白含量上升而氨基酸含量下降，還原糖含量在整個(gè)發(fā)酵過程中持續(xù)降低。發(fā)酵6天后主要酚類物質(zhì)總量顯著上升（p＜0.05)，與未發(fā)酵相比提高了8.58%，綠原酸、蘆丁和紫云英苷含量在發(fā)酵過程中呈先上升后下降趨勢(shì)，而咖啡酸和槲皮素含量呈一直上升趨勢(shì)。發(fā)酵第6天時(shí)DPPH與ABTS+自由基清除率比未發(fā)酵樣品分別提高了18.90%和14.78%。總體來看，發(fā)酵6天對(duì)羅布麻葉的總蛋白及氨基酸總量無顯著影響，但顯著提高了其主要酚類物質(zhì)的總量及抗氧化能力。

關(guān)鍵詞: 羅布麻葉；黑曲霉；營(yíng)養(yǎng)成分；微生物發(fā)酵

 

羅布麻（Apocynum venetum L.）是一種多年生宿根草本植物，隸屬于夾竹桃科羅布麻屬，主要分布在中國(guó)的遼寧、吉林、山西、陜西、新疆等地區(qū)。據(jù)報(bào)道，新疆吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州尉犁縣的羅布麻資源高達(dá)53.33萬hm^2[1]。羅布麻作為纖維作物，目前主要運(yùn)用于紡織^[2-3]，這限制了其資源的利用。羅布麻葉是羅布麻的干燥葉，常被用作茶飲，是一種歷史悠久的中草藥。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》的記載^[4]，羅布麻葉具有“清熱利水，平肝安神”等功效，廣泛用于高血壓、頭暈、心悸、失眠、高血脂、神經(jīng)衰弱及浮腫尿少等治療。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的深入研究表明，羅布麻葉中含有包括槲皮素、異槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等活性成分，且富含氨基酸、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)^[5-7]，是良好的藥食同源產(chǎn)品開發(fā)的資源。羅布麻因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及顯著的高血壓治療效果正受到越來越多的關(guān)注。

微生物發(fā)酵具有改善產(chǎn)品風(fēng)味的作用，是提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的有效方法之一。崔藝燕等^[8]利用康寧木霉固態(tài)發(fā)酵茶渣，提高了茶渣中多種游離氨基酸含量和必需氨基酸/總氨基酸比值。劉艷等^[9]通過混菌固態(tài)發(fā)酵辣木葉，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的辣木葉粗蛋白、多肽、總氨基酸、必需氨基酸、鮮味氨基酸分別增加了21.02%、83.81%、17.57%、15.28%和8.16%。ZUO等^[10]在研究紅蘋果酒釀造過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中雖然16種氨基酸的種類和含量出現(xiàn)了下降，但在發(fā)酵第8天利用酵母菌發(fā)酵可以使糖徹底轉(zhuǎn)化為醇，保留更多的營(yíng)養(yǎng)成分。Okafor等^[11]測(cè)定了發(fā)酵前后玉米和鷹嘴豆?fàn)I養(yǎng)成分變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵提高了樣品中蛋白質(zhì)含量，且其賴氨酸、色氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸含量均得到了提高。Song等^[12]利用桑黃菌發(fā)酵燕麥、大麥、小米、大米、蕎麥、玉米和薏苡仁，發(fā)酵后粗蛋白、可溶性蛋白含量顯著增加。在燕麥發(fā)酵中，總多酚含量提高了6.23mg QE/g，總黃酮含量提高了21.8mg Rutin/g，且抗氧化能力均得到了提升。顧秋亞等^[13]通過金花菌發(fā)酵沙棘葉，顯著提高了沙棘葉的總黃酮含量及其抗氧化活性。但目前關(guān)于羅布麻發(fā)酵的研究主要集中在生物脫膠^[14-15]，對(duì)其發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)成分變化及抗氧化能力變化的研究較少。黑曲霉（Aspergillus niger）能夠分泌酯酶、糖苷酶、羥化酶等在內(nèi)的多種酶^[16-17]，這些酶在發(fā)酵過程中能誘導(dǎo)化學(xué)成分發(fā)生羥基化、脫羥基、甲基化、脫甲基、去糖基化等一系列反應(yīng)，進(jìn)而生成具有新結(jié)構(gòu)的化合物或中間體，在生產(chǎn)上備受矚目。因此，本研究采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵法對(duì)羅布麻葉進(jìn)行發(fā)酵，研究發(fā)酵不同時(shí)間的羅布麻葉營(yíng)養(yǎng)成分及抗氧化能力的變化及主要酚類物質(zhì)含量的變化，為羅布麻資源利用提供理論參考。

 

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 羅布麻葉與黑曲霉

羅布麻葉于2023年采自福建省南安市羅浮山。自然風(fēng)干后，再在60℃下烘干2h，粉碎過40目篩，備用。黑曲霉（CGMCC5.0809）來源于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

無水葡萄糖、DPPH、硫酸亞鐵、過二硫酸鉀、鐵氰化鉀等試劑，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC16series液相色譜，日本Shimadzu公司。S7130型氨基酸分析儀，德國(guó)Sykam公司。K1100F型全自動(dòng)凱氏定氮儀，中國(guó)山東海能科學(xué)儀器有限公司。Multiskan GO 1510型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，中國(guó)蘇州凈化設(shè)備有限公司。SPX-250B型恒溫培養(yǎng)箱，中國(guó)上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

（1）黑曲霉孢子準(zhǔn)備

將黑曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基后，在28℃下培養(yǎng)7d備用。利用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面的黑曲霉孢子并轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，取部分黑曲霉孢子利用血球板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并調(diào)整溶液孢子濃度為1Í106個(gè)/mL，備用。

（2）羅布麻葉固態(tài)發(fā)酵及樣品準(zhǔn)備

將羅布麻葉粉碎后在121℃條件下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌15min。稱取3g滅菌后的羅布麻葉平鋪于培養(yǎng)皿中，加入5mL無菌水，吸取2mL黑曲霉孢子懸浮液接種到平板對(duì)羅布麻葉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，對(duì)照樣品加入2mL無菌水，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間分別為3、6、9、12d。發(fā)酵后進(jìn)行冷凍干燥處理，稱取1g冷凍干燥粉末，加入20mL70%乙醇，于40℃、500W條件下超聲30min，重復(fù)2次，離心后合并濾液，于4℃保存。

1.3.2 分析檢測(cè)

（1）還原糖含量測(cè)定

參照李秀清等^[18]方法進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中還原糖含量。樣品還原糖含量計(jì)算公式為：

  

式中：X—還原糖含量，mg/g；c—樣品中還原糖濃度，μg/mL；t—稀釋倍數(shù)；m—羅布麻葉粉末質(zhì)量，g；V—樣品體積，mL。

（2）蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。取0.5g樣品，放入消化管中加入凱氏定氮片及濃硫酸10mL，在400℃下消化3h，加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氮?dú)庖莩?，用硼酸進(jìn)行吸收后酸滴定，測(cè)出氮含量，最終乘以換算系數(shù)6.25計(jì)算粗蛋白含量。

（3）氨基酸含量測(cè)定

氨基酸含量測(cè)定參照GB5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀SykamS7130測(cè)定發(fā)酵前后游離氨基酸含量。

（4）酚類物質(zhì)含量測(cè)定

供試品：稱取羅布麻葉粉末1g，置于50mL離心管中，以1:20比例加入70%乙醇，在45℃、500W條件下超聲輔助提取30min，離心取上清，重復(fù)2次，合并所得濾液，過0.45μm微孔濾膜即得。

對(duì)照品：分別精密稱取對(duì)照品綠原酸、咖啡酸、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、木犀草苷、紫云英苷置于量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度分別為333.33μg/mL綠原酸、500.00μg/mL咖啡酸、500.00μg/mL蘆丁、342.60μg/mL槲皮素、129.63μg/mL金絲桃苷、533.33μg/mL木犀草苷、566.67μg/mL紫云英苷的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，在4℃下保存。

色譜條件：C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度程序，0～8min，5%A～12%A；8～20min，12%A～18%A；20～45min，18%A～25%A；45～50min，25%A～35%A；50～52min，35%A～5%A；52～57min，5%A；柱溫35℃；體積流量0.8mL/min；進(jìn)樣量10μL，檢驗(yàn)波長(zhǎng)256nm。

（5）抗氧化能力測(cè)定

DPPH自由基清除率：參考Williams等[19]的方法略有修改，在1mL樣品中加入1mL的DPPH（0.2mmol/L）與1mL樣液，以等量無水乙醇作為空白對(duì)照，在室溫下黑暗反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)量反應(yīng)溶液的吸光度。吸光度越低，DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。自由基清除率計(jì)算公式如下：

  

式中：X—DPPH自由基清除率，%；A₁—樣品在517nm下吸光度值；A₂—空白組在517nm下吸光度值。

ABTS自由基清除率：參考Re等^[20]方法略有修改，取7.4mmol/LABTS原液與2.6mmol/L過硫酸鉀各5mL，在室溫下靜置12～16h后使用。在檢測(cè)前，將原液用95%乙醇稀釋，使其在734nm處檢測(cè)的吸光度為0.700±0.02。將0.8mLABTS溶液與0.2mL樣品混合，用95%乙醇作為空白組替代樣品，在室溫下避光保存6min，在734nm處測(cè)量樣品的OD值。清除率按下式計(jì)算：

  

式中：X—ABTS自由基清除率，%；A₁—樣品在734nm下吸光度值；A₂—空白組在734nm下吸光度值。

羥自由基清除率：利用Fenton反應(yīng)得到羥自由基H₂O₂+Fe²⁺=·OH+H₂O+Fe³⁺，該反應(yīng)生成的羥自由基可以與水楊酸反應(yīng)，生成的2,3-二羥基苯甲酸，其溶液為紫色，并且在510nm有最大吸收。如在以上反應(yīng)體系中加入抗氧化劑，溶液顏色會(huì)變淺。方法如下：將2mLFe(OH)₂溶液（6mmol/L）、2mL樣品溶液與2mLH₂O₂溶液混合，反應(yīng)10min后加入2mL水楊酸溶液（6mmol/L），振蕩搖勻靜置30min；空白對(duì)照組用等量的純水替代樣品溶液，其他條件不改變。在510nm光度下測(cè)量吸光度。羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

  

式中：X—羥自由基清除率，%；A₁—試驗(yàn)組在510nm下吸光度值；A₂—對(duì)照組在510nm下吸光度值。

總還原力：總還原力參考何艷麗等^[21]方法略有修改，取1mL待測(cè)樣等比例加入0.2mol/L磷酸緩沖鹽溶液和2.5mL1%K₃Fe(CN)₆溶液混合，在50℃恒溫水浴20min，取出后加入2.5mL10%三氯乙酸溶液，于8000r/min離心5min，取上清液2.5mL和純水等比混合后加入0.5mL0.1%FeCl₃溶液，混勻反應(yīng)10min后于700nm處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有測(cè)試數(shù)據(jù)均用3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，利用GraphPad8.0軟件進(jìn)行圖表繪制、方差分析和Tukey檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異顯著水平。

 

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后羅布麻葉還原糖含量變化

所求葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0002x+0.0457（R²=0.9972），在0～1mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

由圖1可知，在發(fā)酵過程中樣品中還原糖含量呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵的前3天下降最為顯著，發(fā)酵第9天到12天，還原糖含量無明顯變化，逐漸趨于平穩(wěn)。發(fā)酵初期還原糖含量顯著下降，表明黑曲霉快速利用了羅布麻葉中的糖源。隨著發(fā)酵時(shí)間的延續(xù)，還原糖含量趨于平穩(wěn)，說明糖源已基本消耗完畢，黑曲霉的生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。

  

圖1 發(fā)酵不同時(shí)間樣品中還原糖含量變化

注：不同字母代表差異顯著（p < 0.05）。

2.2 發(fā)酵前后羅布麻葉蛋白含量變化

對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間羅布麻葉樣品中蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，未發(fā)酵羅布麻葉中蛋白含量為6.78%±0.1%，在發(fā)酵的前9天樣品中蛋白含量無明顯變化，發(fā)酵12天樣品與未發(fā)酵及發(fā)酵的前6天樣品中蛋白質(zhì)含量有顯著性差異。與未發(fā)酵相比，發(fā)酵12天的樣品蛋白含量提高了9.53%。由于未添加額外的氮源，發(fā)酵初期蛋白含量無顯著變化，可能是由于黑曲霉處于適應(yīng)階段，其代謝活動(dòng)主要集中在生長(zhǎng)上，對(duì)底物的分解和轉(zhuǎn)化效率較低，導(dǎo)致蛋白含量變化不明顯。然而，在發(fā)酵后期，黑曲霉逐漸進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)階段，代謝活動(dòng)增強(qiáng)。隨著黑曲霉菌體生長(zhǎng)和酶的積累，蛋白含量出現(xiàn)了提升，與湯小朋等^[22]研究結(jié)果相一致。在發(fā)酵過程中，微生物利用底物中氮源的同時(shí)提高自身的菌體蛋白含量，如黑曲霉菌通過孢子繁殖的方式從膨大的菌絲上產(chǎn)生分生孢子梗^[23]，并分泌多種蛋白從而導(dǎo)致粗蛋白含量提高。但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)?shù)孜锊蛔阋怨┙o所需要的能量，微生物代謝活動(dòng)會(huì)逐漸減弱甚至分解自身合成的蛋白質(zhì)已獲取能量，會(huì)導(dǎo)致蛋白含量不再增加甚至下降。

  

圖2 發(fā)酵不同時(shí)間樣品中蛋白含量變化

注：不同字母代表差異顯著（p < 0.05）。

2.3 發(fā)酵前后羅布麻葉氨基酸含量變化

對(duì)樣品中氨基酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1所示，測(cè)得未發(fā)酵羅布麻樣品中17種氨基酸總量（TAA）為56.57mg/g，必需氨基酸（EAA）含量為22.22mg/g，EAA/TAA占比為39.28%，非必需氨基酸（NEAA）含量為34.35mg/g，NEAA/TAA占比為64.70%，藥用氨基酸占比為56.92%。在羅布麻中含有的17種氨基酸中，含量排前3位的分別為Glu、Asp、Leu，占TAA的34.50%；含量最低的3種氨基酸分別為Cys、Met、Trp，僅占TAA的5.37%。

在發(fā)酵樣品中，與未發(fā)酵相比，Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、Tyr和Trp7種氨基酸含量無顯著變化，Cys和His在發(fā)酵第6天顯著上升。整體來看，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵的前6天氨基酸含量變化不大，發(fā)酵第6天TAA僅比未發(fā)酵高0.62mg/g，但發(fā)酵至第12天，氨基酸含量大幅度下降，比未發(fā)酵下降了6.77mg/g。在發(fā)酵過程中，必需氨基酸與總氨基酸含量變化趨勢(shì)一致，且發(fā)酵后EAA/TAA均高于未發(fā)酵，發(fā)酵第12天EAA/TAA比值為0.408，達(dá)到WHO/UN關(guān)于理想蛋白質(zhì)中EAA/TAA比值高于0.4的要求。不同發(fā)酵天數(shù)羅布麻葉的必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量的比值（EAA/NEAA）范圍在0.647～0.689，均高于WHO/FAO理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求的0.6，且藥用氨基酸與總氨基酸比值均超過50%。盡管發(fā)酵9天后蛋白含量提高，但氨基酸含量的變化并不顯著，蛋白質(zhì)由氨基酸構(gòu)成，一般情況下，總氨基酸含量會(huì)低于或相當(dāng)于總蛋白含量。凱氏定氮法僅對(duì)樣品中粗蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，是以樣品中氮逸出量，再根據(jù)換算系數(shù)6.25計(jì)算得到，與樣品實(shí)際值會(huì)有一定偏差。測(cè)定結(jié)果表明，在未發(fā)酵樣品中氨基酸含量?jī)H為5.66%，而耿伊雯等^[7]對(duì)甘肅及內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)，其中甘肅省民勤縣羅布麻總游離氨基酸含量為14.426%，內(nèi)蒙古杭錦旗羅布麻氨基酸含量?jī)H為7.671%，說明不同產(chǎn)地羅布麻的氨基酸含量差異明顯。菅麗君等^[24]對(duì)新疆羅布麻中氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明新疆羅布麻氨基酸含量為11.82g/100g，遠(yuǎn)高于福建產(chǎn)地羅布麻中氨基酸含量，但必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值（40.7%）與本研究所得結(jié)果（39.28%）相差不大。羅布麻中氨基酸含量因產(chǎn)地有所差異，但其必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值相差不大。

表1 黑曲霉發(fā)酵前后羅布麻葉樣品中氨基酸含量

  

  

注：同一行中不同字母代表差異顯著（p<0.05）。

2.4 發(fā)酵前后羅布麻葉主要酚類物質(zhì)含量變化

取7種標(biāo)準(zhǔn)品按照1.3.2方法進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖3所示，利用Excel軟件記錄峰面積并分別計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，7種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表2。

表2 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

   

  

圖3 主要酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

注：1—綠原酸；2—咖啡酸；3—蘆丁；4—金絲桃苷；5—木犀草苷；6—紫云英苷；7—槲皮素。

對(duì)樣品中7種酚類物質(zhì)進(jìn)行分析，其色譜圖如圖4所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果求得樣品中各類物質(zhì)含量如表3所示，經(jīng)不同發(fā)酵時(shí)間后的樣品中均存在綠原酸、咖啡酸、蘆丁和槲皮素等7種成分，其中在未發(fā)酵樣品中，綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷幾種物質(zhì)含量較高，分別為6.71±0.42、11.37±0.55、2.26±0.11、6.65±0.31mg/g，在發(fā)酵過程中7種物質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間出現(xiàn)顯著變化（p＜0.05）。在發(fā)酵第3天，紫云英苷含量顯著上升，在發(fā)酵第6天，咖啡酸、蘆丁、槲皮素和紫云英苷含量比未發(fā)酵樣品都有所上升。到發(fā)酵第9天及12天，綠原酸、金絲桃苷和木犀草苷含量有所下降。整體來看，綠原酸、蘆丁和紫云英苷含量在發(fā)酵過程中呈先上升后下降趨勢(shì)，而咖啡酸和槲皮素含量呈一直上升趨勢(shì)。對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間羅布麻葉中7種物質(zhì)總含量來說，在發(fā)酵第6天含量最高，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，總含量有所下降。

表3 黑曲霉發(fā)酵不同時(shí)期羅布麻葉樣品中 7 種酚類物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

  

注：同列不同小寫字母代表差異顯著（p<0.05）。

  

圖4 羅布麻樣品液相色譜圖

注：1～3代表未發(fā)酵樣品，4～6代表發(fā)酵3天樣品，7～9代表發(fā)酵6天樣品，10～12代表發(fā)酵9天樣品，13～15代表發(fā)酵12天樣品。

酚類物質(zhì)是羅布麻中一類主要的活性物質(zhì)，Espitia-Hernández等^[25]研究表明，黑曲霉Aa210發(fā)酵高粱提取物可以提高其總黃酮含量，黑曲霉發(fā)酵處理可使玉竹黃酮抗氧化能力提高3.59%^[26]。本研究利用黑曲霉對(duì)羅布麻進(jìn)行不同發(fā)酵時(shí)間處理，在發(fā)酵第6天提高了其主要酚類物質(zhì)總含量（p＜0.05）。其次，在發(fā)酵過程中綠原酸含量和蘆丁含量下降，而咖啡酸和槲皮素含量上升，這些變化表明黑曲霉對(duì)酚類物質(zhì)的代謝具有顯著影響。研究表明，黑曲霉AKU3302^[27]可以水解馬黛茶中綠原酸生成奎尼酸和咖啡酸，黑曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的糖苷酶也可以將蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素^[28]。

2.5 發(fā)酵前后羅布麻葉抗氧化能力變化

羅布麻葉不同發(fā)酵時(shí)間提取物抗氧化能力如表4所示，不同發(fā)酵時(shí)間樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨發(fā)酵時(shí)間先增加后下降。其中發(fā)酵第6天時(shí)DPPH自由基清除率最高，與未發(fā)酵相比，清除率提高了18.90%。ABTS⁺是一種合成自由基，可用于評(píng)估極性和非極性抗氧化物質(zhì)的清除活性。通過對(duì)ABTS⁺自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在發(fā)酵第6天及12天ABTS+清除率最高，其中第6天比未發(fā)酵樣品清除率提高了14.78%。羥自由基清除率在第9天最高，與未發(fā)酵相比提升不大，而總還原力在整個(gè)發(fā)酵過程中均無顯著性變化。

表4 黑曲霉發(fā)酵不同時(shí)期樣品中抗氧化能力變化

  

注：同列中不同小寫字母代表差異顯著（p<0.05）。

 

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前，羅布麻制茶主要包括清洗、去堿、晾曬（殺青）、揉捻、炒制等工藝流程，僅有少量研究報(bào)道了發(fā)酵工藝?，F(xiàn)有公開的發(fā)明專利中，羅布麻葉發(fā)酵采用的菌種包括天然復(fù)合菌、假絲酵母^[29]、枯草芽孢桿菌、乳酸菌^[30]、金花孢子（冠突散囊菌）^[31]、釀酒酵母^[32]等，同時(shí)存在酶處理（如纖維素酶、單寧酶等）的方式。這些方法的主要意圖是釋放羅布麻生物活性物質(zhì)、改善羅布麻的口感等。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)比了米曲菌（Aspergillus. oryzae）、紅曲霉菌（Monascus purpureus）和黑曲霉菌發(fā)酵效果，發(fā)現(xiàn)黑曲霉菌發(fā)酵可以顯著提高多酚類和黃酮類物質(zhì)的含量^[33]。本研究進(jìn)一步分析了黑曲霉菌發(fā)酵對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)、還原糖、主要酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的變化特征，為開發(fā)高效羅布麻茶發(fā)酵工藝提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究利用黑曲霉對(duì)羅布麻葉進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵過程中還原糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和酚類物質(zhì)的變化進(jìn)行系統(tǒng)分析，揭示了黑曲霉發(fā)酵對(duì)羅布麻葉中營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)的顯著影響。發(fā)酵初期，黑曲霉快速利用糖源，導(dǎo)致還原糖含量下降；發(fā)酵后期，黑曲霉的生長(zhǎng)和代謝促進(jìn)了蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)含量的提升。氨基酸含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先穩(wěn)定后下降的趨勢(shì)，但必需氨基酸與氨基酸總量的比值顯著提高，符合理想蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵改變了羅布麻中主要酚類物質(zhì)含量，在酚類化合物中，鑒定出7個(gè)主要化合物。其中發(fā)酵6天對(duì)酚類物質(zhì)釋放總量最佳，主要酚類物質(zhì)含量提高了8.58%，且其抗氧化能力得到有效提升，表明黑曲霉發(fā)酵對(duì)羅布麻的活性物質(zhì)代謝具有重要作用。結(jié)合綠原酸、蘆丁含量呈先上升后下降趨勢(shì)，而咖啡酸與槲皮素含量呈一直上升趨勢(shì)，推測(cè)一方面可能由于黑曲霉分泌相關(guān)碳水化合物水解酶，促進(jìn)了羅布麻葉中這幾種物質(zhì)的釋放，另一方面，隨著綠原酸、蘆丁的積累，可能綠原酸和蘆丁分別被水解為咖啡酸、槲皮素等物質(zhì)。

本研究主要關(guān)注發(fā)酵前后羅布麻葉成分的變化及抗氧化活性，為探索黑曲霉發(fā)酵對(duì)羅布麻資源開發(fā)的潛在價(jià)值提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。研究認(rèn)為羅布麻中的糖苷類物質(zhì)主要以多糖苷為主，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血脂等生物活性^[34]。本研究主要針對(duì)黑曲霉發(fā)酵促進(jìn)還原性糖降解進(jìn)行了分析，但尚未針對(duì)生物活性多糖開展研究。未來還應(yīng)結(jié)合代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，深入挖掘更多潛在的功能成分，研究黑曲霉發(fā)酵對(duì)羅布麻中活性物質(zhì)的作用機(jī)制，為羅布麻資源的開發(fā)利用提供理論支持，推動(dòng)其在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

 

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文章摘自:林登蕃，易著虎，蘭小明，周心怡，周映君，朱作華，嚴(yán)理，胡鎮(zhèn)修，彭源德，謝純良．羅布麻葉發(fā)酵前后主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化及抗氧化活性研究[J/OL]．中國(guó)麻業(yè)科學(xué).https://link.cnki.net/urlid/43.1467.S.20250320.1644.009。