摘 要: 為探究苧麻內生細菌對苧麻田間生長的影響，試驗從苧麻莖中分離了一株巨大芽孢桿菌，在大田中對苧麻進行灌根，設置巨大芽孢桿菌液（C1）和LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基CK）兩種處理，在第一次處理苧麻50d后，收獲并測量其植株的農藝性狀、生理指標以及土壤的營養(yǎng)元素和酶活等指標，分析外施內生細菌對大田苧麻生長的影響。結果表明，巨大芽孢桿菌C1能顯著提高苧麻的株高、莖粗、皮鮮重和皮干重，相較于CK，C1處理的土壤中性磷酸酶活性提升，脲酶活性下降,關聯分析顯示兩種酶活性與苧麻產量顯著相關。土壤氮磷鉀元素的變化也表現出C1處理的苧麻有更強的吸收土壤養(yǎng)分的能力。苧麻內生巨大芽孢桿菌可以較好的促進苧麻生長，試驗結果有望為苧麻內生菌的開發(fā)利用，推動苧麻產業(yè)發(fā)展奠定理論基礎。
關鍵詞：苧麻；內生細菌；促生
苧麻（Boehmeria nivea(L.)Gaudich.）為蕁麻科苧麻屬多年生宿根植物，是重要的纖維作物，其纖維強度較高，紡織出的面料具有抗菌、防腐、透氣等特性[1]，苧麻紡織物經特殊處理后還可以作為阻燃材料[2]。苧麻纖維具有高度相容性，可以作為優(yōu)良的醫(yī)學縫合材料[3]。苧麻根部可入藥，具有清熱、安胎、涼血和止血等作用[4]。苧麻莖葉富含蛋白，在家兔、山羊、鵝和豬等動物[6-8]飼養(yǎng)中作為飼料原料或青貯飼料使用，可以提升禽畜的品質和產量。雖然，苧麻具有較高的經濟和應用價值，但在其栽培過程中需要大量的肥料以維持苧麻的生長，同時經常出現的旱澇災害造成了苧麻減產，所以，提高苧麻的肥料利用率以及抗逆能力是其生產中的一項重要挑戰(zhàn)。
植物中的部分內生細菌或真菌具有促生長、抗蟲、抗病和輔助植物抵御非生物脅迫的效用。內生真菌通常與植物結合形成菌根，如叢枝根菌、蘭花菌根和杜鵑菌根[9]等，形成的菌根輔助植物吸收水分和營養(yǎng)，有的菌根還會在植物之間傳遞信號[10]。研究較多的內生細菌有根瘤菌、芽孢桿菌和假單胞菌等，這些內生細菌在薰衣草、油菜、辣椒和茄子等園藝作物[11-13]上有所應用且都取得了積極效果。在糧食作物中有益內生細菌多集中在促生和抗脅迫方面的研究，如內生菌對玉米的肥料吸收及產量的影響[14]，水稻的抗病蟲害過程中內生菌起到的調控作用[15-16]和內生菌對小麥種子發(fā)芽率的影響[17]。對植物內生菌的研究及開發(fā)也是農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重點之一，合理的應用微生物菌肥可以節(jié)約肥料同時提升農產品品質[18-19]。苧麻內生菌相關的研究主要有拮抗病原菌的生防菌篩選[20]，幫助苧麻修復鎘污染的土壤[21]以及對苧麻根部內生菌的篩選和鑒定[22]等，但是內生細菌在苧麻田間生產方面的應用研究較少。大田環(huán)境較為復雜且不可控因素較多，對大田中栽培的苧麻進行直接處理可以得到更接近實際生產的效果。所以，本研究以主栽品種“中苧1號”為對象，在大田中使用從苧麻莖中篩選到的1株巨大芽孢桿菌對其進行處理，探究內生菌對苧麻田間生長的影響，為開發(fā)苧麻的有益內生菌提供依據。
1 材料與方法
1.1 試驗地點
試驗地點為中國農業(yè)科學院麻類研究所白箬鋪試驗基地。
1.2 試驗材料
1.2.1 苧麻
選用試驗基地苧麻田中的“中苧1號”麻蔸。該麻蔸是收獲第二季麻7d后的麻蔸，由扦插苗發(fā)育而來。
1.2.2 供試菌株及培養(yǎng)條件
從苧麻莖部分離出1株內生細菌，前期經測序鑒定后，確定為巨大芽孢桿菌，用LB液體培養(yǎng)基（酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、胰蛋白胨10g/L）32℃培養(yǎng)48h，備用。
1.3 試驗方法
1.3.1 巨大芽孢桿菌促生能力檢驗
將菌液分別滴加到解有機磷、解無機磷和產鐵載體的驗證平板上，驗證細菌對營養(yǎng)元素的利用能力[23-24]。將菌液12000r/min，10min離心取上清，用Salkowskis比色液與上清液2：1測試細菌產IAA能力[25]。
1.3.2 巨大芽孢桿菌的田間處理試驗設計
將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h后用LB液體培養(yǎng)基將菌液濃度調到OD600=1.0。設置C1（巨大芽孢桿菌）和CK（無菌LB液體培養(yǎng)基）兩個處理，每個處理3個重復，每個重復5篼苧麻。在每蔸苧麻旁澆灌300mL菌液或300mL無菌LB液體培養(yǎng)基。自第一次處理后隔7d再處理一次，自第一次處理50d后苧麻基本完成第三季的生長，收獲苧麻地上部并采集地下5cm處土壤，以備后續(xù)試驗。土壤理化性質測定方法參考土壤農化分析[26]，其中，土壤全氮采用凱氏定氮法、全磷采用鉬銻抗比色法、全鉀采用火焰光度法、有機質采用外加熱法、堿解氮采用堿解擴散法、速效磷采用碳酸氫鈉浸提－鉬銻抗比色法、速效鉀采用醋酸銨浸提結合火焰光度法進行測定。
1.3.3 植株生理、產量和土壤酶活性指標測定
試驗完成后，取苧麻地上部，測量其株高和莖粗，將苧麻皮剝去后測量其皮厚，并稱鮮重，曬干后稱其干重，除以每組苧麻的分枝數得到平均干重和鮮重。取苧麻生長點嫩葉用試劑盒（索萊寶，中國）測超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）和可溶性糖含量。取地下5cm處土壤過篩風干后，用pH計測土壤pH值，用試劑盒（格銳思，中國）測土壤中性磷酸酶（S-NP）、蔗糖酶（S-SC）、脲酶（S-UE）和過氧化氫酶（S-CAT）活性。
1.4 數據處理
采用SPSS、GraphPad Prism8和Excel進行數據和圖像處理，LSD法進行比較分析。使用Genes Cloud網站（https://www.genescloud.cn）繪制關聯熱圖。
2 結果與分析
2.1 菌株促生能力檢驗
將C1接種到解有機磷固體培養(yǎng)基、解無機磷固體培養(yǎng)基和產鐵載體培養(yǎng)基上，發(fā)現C1菌具有溶有機磷和無機磷及產鐵載體的功能。菌液上清經過和Salkowskis比色液反應后呈現紅色表示C1還具有產IAA能力（圖1）。
圖1 巨大芽孢桿菌（C1）促生特性檢測
注：菌液在對應的培養(yǎng)基上發(fā)生相應的顏色變化表示菌株具有相應的能力，顯示液出現紅色表明菌株具有產IAA能力。
2.2 苧麻農藝性狀及生理指標
測量了苧麻的株高、莖粗和皮厚發(fā)現，C1處理可以顯著提高苧麻的株高和莖粗。C1處理的苧麻株高平均值為110.50cm，較CK處理的平均株高90.71cm提高了21.82%。C1處理的平均莖粗為7.23mm，較CK處理的6.86mm提升了5.39%。但是，C1處理的苧麻麻皮變薄，相較于CK處理的平均皮厚0.54mm，C1處理的平均皮厚為0.46mm，較CK降低了17.39%（圖2）。
圖2 C1 處理對苧麻株高、莖粗和皮厚的影響
注：圖中數值表示平均值±標準偏差，不同的字母代表不同處理間差異顯著（LSD，p < 0.05）。
苧麻的經濟產品是麻皮，測量了收獲后的苧麻分枝數和麻皮重量發(fā)現，C1處理的苧麻平均分枝數較CK多出7個，且鮮皮重和干重均高于CK，以干重來看，C1處理提高了約18.97%的重量。苧麻葉片可溶性糖積累量沒有顯著差異，但是兩組處理的抗氧化酶活性有較為明顯的差異，C1處理后苧麻POD活性顯著高于CK，而SOD活性顯著低于CK，CK的MDA含量顯著高于CK“（表1），C1處理的苧麻MDA顯著低于CK，表明C1處理的苧麻膜損傷程度低于CK。
表1 C1處理對苧麻生理指標及產量的影響
注：表中數值表示平均值±標準差，同列不同的字母代表不同處理間差異顯著（LSD，p < 0.05）。
2.3 土壤 pH、酶活性及理化性質指標
CK處理的土壤pH為6.51，C1處理的土壤pH為6.43，C1處理組較CK組土壤pH略低。酶活性的結果顯示，C1處理的土壤中性磷酸酶和過氧化物酶的活性顯著高出CK，而土壤的脲酶活性顯著低于CK，兩組土壤的蔗糖酶活性無顯著差異。
表2 C1對苧麻栽培土壤酶活性的影響
注：表中數值表示平均數±標準差，同列不同字母代表不同處理間差異顯著（LSD，p＜0.05）。
C1處理的苧麻根際土壤的全氮、全磷、堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質含量均顯著低于CK，土壤的全鉀含量未出現顯著變化（表3）。其中，變化幅度最大的是速效鉀，C1處理的較CK降低了54.28%。
表3 C1處理對苧麻根際土壤理化性質的影響
注：表中數值表示平均值±標準差，不同字母代表不同處理間差異顯著（LSD，p<0.05）。
2.4 苧麻農藝性狀與生理指標、土壤指標的關聯分析
將苧麻農藝性狀與土壤酶活、植株生理指標進行關聯分析，POD和S-NP與農藝性狀有較為明顯的正相關，而SOD和S-UE與農藝性狀有顯著負相關。農藝性狀中的莖粗與除可溶性糖以外的指標均有顯著相關，同時，可溶性糖這一指標與所有農藝性狀沒有顯著相關。在所有指標中，POD、SOD、S-NP和S-UE是較為重要的指標。
圖3 苧麻農藝性狀與生理指標及土壤酶活性關聯分析
注：“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01。
3 討論
本試驗前期在苧麻莖中分離到1株巨大芽孢桿菌，具有產IAA、解磷和固氮等功能，將其處理苧麻后，苧麻的鮮重和干重均有顯著提升，分枝數也較CK有一定提升但未達到顯著差異。巨大芽孢桿菌在其他作物中有較多報道，如在小麥研究中，巨大芽孢桿菌的添加可以提高小麥的發(fā)芽率和產量[27-28]；向日葵種子經芽孢桿菌處理后，生長出更長的根長和更大的葉片[29]。在蘋果生產中，巨大芽孢桿菌的添加提升了蘋果的品質和栽種蘋果土壤的速效磷、速效鉀含量[30]。由此看來，巨大芽孢桿菌是一種廣泛存在于植物體內的有益內生菌。
在大田試驗中，巨大芽孢桿菌菌液處理的苧麻表現出較高的POD活性和較低的SOD活性及MDA含量，SOD將超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，POD則是清除過氧化氫，這兩個酶同屬抗氧化酶，起到清除活性氧和自由基的作用，過量的活性氧和自由基會損害質膜積累MDA，而施加巨大芽孢桿菌的苧麻則出現SOD活性下降、POD活性上升的現象，從MDA含量來看，巨大芽孢桿菌處理減小了苧麻細胞膜的損傷。施加巨大芽孢桿菌緩解脅迫的情況同樣也發(fā)生在花生、景天和棉花等作物上[31-33]，番茄的研究中也發(fā)現巨大芽孢桿菌可以提升番茄的防御酶活性[34]。
關于巨大芽孢桿菌與植物互作機制的研究也有一些報道，Zhang等[35]給狼尾草接種巨大芽孢桿菌后，發(fā)現狼尾草中大多數與光合作用相關的蛋白被上調。Mehtab等[36]發(fā)現巨大芽孢桿菌會促進羽扇豆根部釋放磷酸酶從而提升植物獲取磷的能力。苧麻的產量主要由莖纖維決定，這就意味著高的苧麻產量需要更長的株高、更粗的莖粗和更多的纖維含量，巨大芽孢桿菌的施加可能導致植株對土壤營養(yǎng)元素吸收能力的變化，從而讓苧麻更好的進行營養(yǎng)生長。施菌處理后土壤中性磷酸酶和脲酶活性出現差異，土壤磷酸酶的作用是將土壤中的有機磷礦化為無機態(tài)，從而供作物吸收，巨大芽孢桿菌具有解有機磷的功能，推測巨大芽孢桿菌的添加是土壤磷酸酶活性提升的直接原因，在上文羽扇豆的研究[36]中提到，巨大芽孢桿菌的添加可以提高植物酸性磷酸酶的表達量從而促進根鞘獲取磷的能力。在苧麻根際土壤中全磷和速效磷的含量顯著降低，推測施菌處理提升了苧麻對土壤中磷元素的吸收能力。巨大芽孢桿菌處理的苧麻土壤的脲酶活性顯著低于CK，脲酶是對尿素轉化起關鍵作用的酶，脲酶通過酶促反應為植物提供可利用的氮源，在不同區(qū)域土壤酶活性的研究中發(fā)現，土壤脲酶與土壤氮素含量呈正相關[37-38]。苧麻是一種高蛋白含量的作物[39]，在苧麻選育過程中通常將株高作為重點選擇指標。苧麻顯著提升的株高和莖粗意味著苧麻需要從土壤中吸收更多的營養(yǎng)元素，尤其是氮素，這可能是土壤脲酶活性下降的原因之一；另一方面，脲酶活性的下降意味著尿素分解速度的下降[40]，植物需要更長時間的獲取氮元素并提高氮素的利用率，在關聯分析中，脲酶活性與苧麻產量呈顯著負相關，苧麻根際土壤中的氮素下降也說明施菌調動了苧麻對氮元素的吸收。除了氮和磷外，巨大芽孢桿菌處理的苧麻根際土壤中的有機質和速效鉀含量也低于CK，說明施菌處理的苧麻對碳源和鉀元素的利用能力也有提升。在整個試驗過程中沒有施加肥料，施菌處理的土壤中各種酶的活性和較低的肥力，巨大芽孢桿菌促進了苧麻對營養(yǎng)元素的吸收。在施加巨大芽孢桿菌后，對苧麻的生理指標和產量產生了積極影響，但是值得注意的是施菌處理的苧麻莖皮變薄，莖皮厚度在一定程度上會影響苧麻最終產量，解決莖皮變薄也是后續(xù)研究需要關注的問題。
4 結論
本研究用苧麻體內分離的1株促生巨大芽孢桿菌，通過大田試驗驗證其有提高苧麻產量和提高苧麻抗氧化的能力，并且還可以調整土壤酶系統(tǒng)和促進苧麻吸收土壤中的營養(yǎng)元素。這為苧麻促生菌的開發(fā)提供了資源和依據，也有利于推進苧麻綠色種植。
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